十九世纪以来,抗生素对我国养殖业防治细菌性疾病起到至关重要的作用,随着抗生素的广泛应用,与其相对应的滥用、残留等问题也相继出现,食品安全和健康养殖逐渐受到人们的关注,所以探寻可替代抗生素功能的产品成为畜牧业以及相关行业的当务之急,因此,寻找开发无抗药性、无残留、抗炎和提高机体免疫能力等优点的替抗药物是目前唯一的有效途径。而θ-防御素1（RTD-1）是动物来源的唯一环状肽,其分子量一般在2 k Da左右,具有广谱抗菌、无残留、无耐药性、理化性质稳定以及抗炎症和抑制流感病毒的粘附等功能。但θ-防御素1从生物提取或化学合成的成本过高、产量低、纯化步骤繁琐等成为其临床应用的一大障碍。通过生物重组合成技术提高θ-防御素1的产量是当前经济且高效的途径,具有良好的应用前景。主要研究及内容如下:1.运用DNAMAN、Primer Premier 5等分子克隆软件,根据θ-防御素1（RTD-1）、内含肽Npu Dna E的氨基酸序列设计并合成融合片段基因序列。凝胶电泳及测序分析显示,其条带大小与理论大小（498 bp）相符。将融合片段克隆到大肠表达载体p ET28a中,构建NRTD-1-p ET28a重组表达载体,并进行转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。2.NRTD-1-p ET28a-DH5α重组菌株经菌液PCR鉴定为阳性子后,测序PCR产物对其双重验证之后提取NRTD-1-p ET28a质粒进行转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。3.重组表达菌株NRTD-1-p ET28a-BL21经IPTG诱导所产生的表达产物破碎后,Tricine-SDS-PAGE电泳分析显示,其表达形式为可溶性表达。表达量约为239 mg/L。其破碎上清,经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,发现产物中有一分子量为2 k Da左右的特异性条带,与理论大小相符,表明RTD-1已被内含肽成功剪接。4.通过葡聚糖凝胶层析分析对纯化样品的进一步分离纯化,运用薄层层析鉴定结果显示表达的RTD-1已成功环化并且结构相对稳定。对RTD-1的稳定性、溶血活性、和杀菌能力进行测定,结果表明其具有良好的耐蛋白酶、耐酸碱和耐热能力。对多株测定致病菌具有较强的杀菌活性,安全性高,无溶血活性。5.以RTD-1粗纯品为样品,初步研究RTD-1对感染大肠杆菌的小鼠的保护效果。实验分为灌服组和注射组进行,结果发现注射组的保护率相比灌服组高,48 h后,小鼠存活率分别为37.5%和12.5%。两组均具有保护效果,表明RTD-1对感染大肠杆菌的小鼠具有一定的保护作用。以上研究表明,本研究成功构建出θ-防御素1（RTD-1）的大肠杆菌表达系统工程菌,并进行其功能的初步研究,通过体内、体外试验证明RTD-1对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有一定的杀菌活性,为将θ-防御素1开发成为一种新型抗病药物提供了一定的理论和基础。