嗜酸性硫杆菌属微生物（Acidithiobacillus spp.）是一类化能自养型细菌,这类细菌能在含有微量O2的环境下,氧化地壳矿石中的铁元素或硫元素获得生长代谢所需的能量,氧化得到的Fe3+作为氧化剂能够析出矿石中的金属。基于这一特性,嗜酸性硫杆菌属微生物作为生物浸矿中的优势菌种被应用于生物冶金行业。嗜酸性硫杆菌属中的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）除具有硫代谢能力外,还具有亚铁氧化代谢能力,是研究各类亚铁氧化细菌（FeOB）的典型代表。目前已报道在A.ferrooxidans模式菌株ATCC 23270中预测的亚铁氧化电子传递模型是一个由“顺电势”和“逆电势”两个分支的电子传递链共同参与的亚铁氧化过程。由rus操纵子编码的顺电势梯度电子传递链接受外界环境中Fe2+氧化成Fe3+失去的电子,由细胞色素c蛋白Cyc2将电子经过一系列电子传递蛋白最终传递给O2生成水,同时伴随着ATP的生成。逆电势梯度电子传递链由petI操纵子编码,少量由Cyc2获得的电子经Rus分支点沿这条电子传递链传递,最终产生细胞生长代谢所需的还原力。模型为研究该菌的亚铁氧化机制提供了参考,但由于该菌的遗传操作难度非常大,模型尚缺少实验验证。研究表明,生物冶金的效率很大程度取决于Fe3+的浓度。目前,亚铁氧化能力不高是生物冶金中重要的限速步骤。因此,深入研究A.ferrooxidans亚铁氧化代谢机制,明确关键蛋白,可为构建具有更高亚铁氧化效率的工程菌奠定理论基础。为深入研究A.ferrooxidans的亚铁氧化机制,本文首先将既能氧化还原性硫化物又能氧化亚铁的A.ferrooxidans ATCC 23270与嗜酸性硫杆菌属中一个只能利用还原性硫化物的A.thiooxidans模式菌株ATCC 19377进行了比较基因组学分析,进一步挖掘与亚铁氧化相关的功能基因,完善对A.ferroooxidans亚铁氧化代谢机制的理解;为探究编码亚铁氧化电子传递链两个操纵子的功能,本文使用两个广泛宿主范围质粒pJRD215-ΔSm和pMSD1,构建了分别含有rus操纵子和petI操纵子的重组质粒pJRD215-ΔSm-Orus和pMSD1-OpetI,采用接合转移技术分别转入A.ferrooxidans ATCC 23270中过表达和转入不具有亚铁氧化功能的A.thiooxidans ATCC 19377中异源表达,通过检测培养基中亚铁离子浓度、菌体生长量以及相关基因的差异性表达情况,发现rus操纵子和petI操纵子的过表达都可提高A.ferrooxidans的亚铁氧化能力和生长,说明两操纵子在该菌亚铁代谢中具有重要作用;发现只在A.thiooxidans中表达rus操纵子或petI操纵子不能使该菌获得以亚铁为唯一能源生长的能力,但可促进该菌以硫粉为能源的生长,且随着Fe2+的加入促进作用更明显,rus操纵子还能使培养液中Fe2+减少,说明rus操纵子能使A.thiooxidans初步具备氧化亚铁的能力,petI操纵子虽不能使菌株直接获得氧化亚铁的能力,但是很可能有助于A.thiooxidans的硫代谢促进其生长。因此,rus操纵子在亚铁氧化中的作用更重要,还需要进一步构建含有rus和petI两个操纵子的A.thiooxidans工程菌并检测其亚铁氧化能力。实验室前期采用无痕敲除技术敲除了亚铁氧化电子传递链第一个受体蛋白Cyc2编码基因cyc2,发现构建的A.ferrooxidans Δcyc2敲除株仍然具有亚铁氧化能力,且AFE1428表达显著上调。由于外膜蛋白Cyc2是rus操纵子中第一个传递亚铁氧化产生的电子的受体,其功能是将电子传递给细胞周质的Rus蛋白,所以推测AFE1428蛋白替代了 Cyc2,但缺少证据。本文先对AFE1428与Cyc2的蛋白结构进行了比对,发现两者具有很高的相似性,均具有保守的血红素A位点,均可形成类似孔蛋白结构域的具有β桶结构的三级结构。通过在大肠杆菌中异源表达和纯化AFE1428、Cyc2和Rus蛋白以及体外Pull-down实验,发现Cyc2和AFE1428均与Rus在体外产生了特异性相互作用,为在A.ferrooxidansΔcyc2敲除突变株中AFE1428蛋白可以替代Cyc2作为第一个电子受体在A.ferrooxidans亚铁氧化代谢中发挥作用的推测提供了支持。萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase,Luc）报告基因被广泛应用于基因表达调控的研究领域,为探究该报告基因在A.ferrooxidans中的应用,本文以AFE1428与cyc2的启动子P1428、PIPII为研究对象,以荧光素酶作为报告基因,检测了质粒上携带的表达盒分别在E.coli和A.ferrooxidans中表达的荧光素酶活性。实验结果表明,荧光素酶可以作为报告基因用于以硫粉为能源培养的A.ferrooxidans,因Fe2+对荧光素酶活性的抑制,在Fe2+能源基质培养条件下的应用受到限制;还发现P1428、PIPII启动子在A.ferrooxidans中具有很高的活性,今后可作为候选启动子,用于外源基因在该菌中的高效转录表达研究基因的功能以及构建更强代谢能力的优良工程菌株。综上,本文通过rus操纵子和petI操纵子分别在A.ferrooxidans中过表达和在A.thiooxidans中异源表达分析了两个操纵子在亚铁氧化代谢中的功能。通过Pull-down实验,验证了 AFE1428蛋白和Cyc2一样,均能在体外与Rus蛋白互作。萤火虫荧光素酶报告基因可在以硫粉为能源培养的A.ferrooxidans中应用。PIPII和P1428可作为外源基因在A.ferrooxidans中高效表达的候选启动子。