惠阳胡须鸡禽白血病病原学调查及受体基因遗传多态性分析

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禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)或肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus,RSV)引起的。近十多年来,AL在我国不断蔓延,其宿主范围已由白羽肉种鸡扩大到蛋鸡、黄羽肉种鸡以及我国多个地方鸡品种。AL除了诱导产生肿瘤性疾病之外,还导致多种亚临床症状,如生长迟缓、免疫功能和生产性能下降等,给养禽业造成了巨大损失。对该病目前无有效的疫苗和药物,主要是通过净化淘汰来防控该病。惠阳胡须鸡是著名的广东省地方鸡品种,已列入2014年修订的《国家级畜禽遗传资源保护名录》,但目前尚未有惠阳胡须鸡AL感染情况的系统报道。本研究拟对惠阳胡须鸡开展AL病原学调查及其病毒受体遗传基因多态性分析,从而为有效保护惠阳胡须鸡地方品种资源提供科学依据。本研究选取了广东省具有代表性的7个惠阳胡须鸡养殖场开展AL病原学调查。这7个养殖场的惠阳胡须鸡均为自繁自养型。分别从A、B、C、D、E、F、G7个场无菌操作采集翅静脉抗凝血55、102、46、50、193、105和299份,经处理后同时接种DF-1细胞和CEF细胞进行病毒分离。这7个场基于DF-1细胞的ALV p27抗原阳性率分别为:1.8%(1/55)、21.5%(22/102)、19.6%(9/46)、24%(12/50)、6.7%(13/193)、18%(19/105)、0%(0/299);这7个场基于CEF细胞的ALV p27抗原阳性率分别为1.8%(1/55)、27.5%(28/102)、17.4%(8/46)、20%(10/50)、7.7%(15/193)、20%(21/105)、0%(0/299)。本研究从850份血浆样品中分离出了48个内源性ALV和72个外源性ALV。其结果提示:所调查的多数惠阳胡须鸡养殖场有外源性ALV的感染;而部分场还有内源性ALV的存在。本研究选取22份内源性ALV的env基因和26份外源性ALV的env基因经PCR扩增、克隆和测序鉴定。结果表明22个内源性ALV均为E亚群ALV(ALV-E),26个外源性ALV均为J亚群ALV(ALV-J),将其分别命名为EGD1701EGD1722及JGD1701JGD1726。ALV-E各分离株的env基因序列相似性在95.4%100%之间,与国内外其他ALV-E参考株的env基因核苷酸序列相似性为89.3%99.7%;ALV-J各分离株的env基因核苷酸序列相似性为89.5%100%之间,与国内外其他ALV-J参考株env基因序列相似性在91.7%96.8%之间。其中B场和F场共有4个ALV-E分离株在env基因359位点处有3个核苷酸CAA的插入;D场有7个ALV-E分离株在env基因627位点处有3个核苷酸TCT的插入;在811位点,B场有6个ALV-E分离株连续突变5个核苷酸,由GATAA变为TGGGG。本研究对A、G养殖场的鸡群采集抗凝血,各抽提全血DNA 31、37份,以抽提出的DNA作为模板分别进行TVA、TVB、NHE1序列的扩增、克隆和测序,对其测序结果进行ALV受体基因遗传多态性分析。TVA序列长度为19992009 bp;TVB序列长度为301 bp;NHE1序列长度为66696676 bp。结果表明,惠阳胡须鸡有2个TVA的抗性等位基因(TVAr3、TVAr4)和1个易感基因(TVAs),A、G场中TVAs、TVAr3、TVAr4的频率分别为0.07/0.22、0.41/0.75、0.52/0.03;惠阳胡须鸡的TVB有1个易感基因型(TVBs1);惠阳胡须鸡ALV-J的受体基因NHE1存在10个突变位点,分别为c.11653C>T、c.11917 C>T、c.11946 C>T、c.13429 T>C、c.13438 T>C、c.14516 A>G、c.14522G>A、c.14654 C>T、c.15834 G>A、c.17560 C>G,但是这些位点均为同义cSNP,并未导致其受体基因氨基酸序列改变。本研究表明,所调查的广东省多个惠阳胡须鸡养殖场有程度不一的ALV-J感染,为有效保护惠阳胡须鸡这个地方品种鸡资源,应启动AL净化;同时部分惠阳胡须鸡养殖场ALV-E的存在也意味着要选择正确的AL净化检测方法。本研究发现惠阳胡须鸡群体中有2个已知的TVA抗性等位基因,为惠阳胡须鸡的抗病育种提供了科学依据。
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