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目的:
葡萄膜炎,是包括了多种眼内炎症的总称,是造成发达国家失明的主要原因之一.目前发病原因尚未明确,临床上治疗葡萄膜炎的一线药是类固醇(例如,地塞米松,曲安奈德).比起全身类固醇治疗,局部类固醇治疗如滴眼液,悬浮液或软膏所引起的副反应更小,更易被患者接受.然而,由于药物在角膜前会被快速清除和角膜渗透性较差,它们的生物利用度较低.在过去的几十年里,已经提出了很多种方法,包括使用黏合剂添加剂,微/纳米技术和水凝胶化,从而延长药物在角膜前的滞留时间和增加类固醇的角膜渗透性,从而提高眼部生物利用度.最近,我们提出了可在特定PH水解的地塞米松超分子水凝胶来用于眼科药物递送.这种水凝胶结合了纳米颗粒和水凝胶的优点,自身充当"自我传送"系统,极大地增加了角膜渗透性并延长了角膜前的滞留时间.
方法:
根据先前的研究,通过使用固相合成法将二氯三苯甲基树脂和N-Fmoc保护的氨基酸合成地塞米松—肽结合物(Dex-SA-FFFE).将30毫克Dex-SA-FFFE粉末加到1毫升磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中,然后加入1mMNa2CO3溶液(相当于1摩尔Dex-SA-FFFE).将得到的悬浮液加热到95℃然后冷却到室温就可以得到Dex-SA-FFFE纳米颗粒.通过ZetasizerNanoZS-90(MalvernInstruments,Malvern,UK)来分析Dex-SA-FFFE纳米颗粒的尺寸分布和zeta电位.通过TEM(TecnaiF20,FEI,Oregon,USA)来观察Dex-SA-FFFE纳米颗粒的微观形态.在37℃的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)和含有20U/mL的猪肝脂酶的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中研究来自Dex-SA-FFFE纳米颗粒的药物(DexandDex-SA-FFFE)的体外释放曲线.为了评估Dex-SA-FFFE纳米颗粒的体外细胞毒性,我们使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测暴露于各种药物浓度后的人角膜上皮细胞系(HECE)的细胞活性.为了评估Dex-SA-FFFE纳米颗粒的体外抗炎作用,我们将用脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞置于不同的药物浓度,然后测量培养基中的炎症因子.我们研究了局部滴注了Dex-SA-FFFE纳米颗粒的健康日本大耳白兔的体内生物相容性和眼部的刺激性.我们评估了Dex-SA-FFFE纳米颗粒在内毒素诱导葡萄膜炎(EIU)兔模型中的体内抗炎作用.数据通过SPSS版本22(IBM)分析数据并表示为均值和标准差(SD).采用单因素方差分析(ANOVA)分析对照组与实验组的显著性差异,p值小于0.05有统计学意义.
结果:
在本文中,我们设计并筛选了一种用可裂解的脂键连接的Dex-SA-FFFE前体药物,它可以在药物前体浓度高达100mg/mL的水溶液中自发组装成纳米颗粒.形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒呈均匀球形,直径约为30nm.相反,DLS分析表明形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒的平均直径约为150±3.4nm,多分散指数(PDI)为0.26±0.09.形成的Dex-SA-FFFE纳米粒子带负电荷(-17.8±1.2mV),这是由于纳米颗粒表面上存在的氨基酸残基的离子化羧酸盐基团.在48小时的研究中,在PBS(pH=7.4)或含有20U/mL酯酶的PBS中,药物(Dex或Dex-SA-FFFE)几乎100%的完全从Dex-SA-FFFE纳米粒子中释放出来.培养24小时后,浓度达到1mM的Dex-SA-FFFE纳米颗粒对HCEC或L-929细胞均无毒性.与对照细胞相比,用LPS处理的RAW264.7巨噬细胞的NO,IL-6和TNF-α显著提高.与LPS组相比,0.01mM和0.1mM的Dex和Dex-SA-FFFE纳米颗粒能够显著抑制NO,IL-6和TNF-α的产生(p<0.05).然而,在测试浓度下,Dex组和Dex-SA-FFFE纳米颗粒组之间没有显著差异.在整个研究期间,使用Dex-SA-FFFE纳米颗粒治疗的眼睛没有显示任何明显的眼部刺激(如角膜水肿、结膜肿胀、晶状体混浊).荧光素钠染色显示角膜上皮层结构正常完整,无明显缺陷.结合一般观察,表面滴注Dex-SA-FFFE纳米粒子后,角膜厚度和眼压无明显变化.在兔眼玻璃体内注射内毒素24小时后,PBS组的眼睛前房中表现出严重的炎症细胞反应,而Dexp组合和Dex-SA-FFFE纳米颗粒组的眼睛表现出轻微的炎症细胞反应,前房有少量的炎性渗出物.根据临床观察,病理组织学观察提示PBS治疗眼内前房呈广泛严重的炎症浸润改变.相反,用Dexp和Dex-SA-FFFE纳米颗粒治疗的眼睛表现为很小的炎症变化,并且在前房中几乎没有炎症细胞浸润.我们注射内毒素24h后测量房水中的细胞因子TNF-α和IL-6的水平.与用PBS处理相比,Dexp和Dex-SA-FFFE纳米颗粒显著抑制房水中TNF-α和IL-6(p<0.05).
结论:
在本文中,我们提出了一种通过酯键连接的可以自组装成纳米颗粒的用于治疗前葡萄膜炎的"自我药物"传递系统的地塞米松-肽结合物(Dex-SA-FFFE)的形成.体外释放研究表明,在48h的研究中,Dex和Dex-SA-FFFE纳米颗粒在PBS或含有20u/mL酯酶的PBS中均可持续释放,PBS中酯酶的添加显著影响了释放药物中Dex/Dex-SA-FFFE的比例.体外细胞毒性试验表明,在24小时内,形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒药物浓度低于1mM对HCEC或L-929细胞几乎无细胞毒性.与此同时,Dex-SA-FFFE纳米颗粒显示出与Dex相当的体外抗炎功效,并显著地抑制经过LPS处理的RAW264.7巨噬细胞产生NO,IL-6和TNF-α.另一方面,形成的Dex-SA-FFFE纳米粒子在体内生物相容性试验中表现出良好的眼部耐受性,因为它们在体内生物相容性试验中对角膜厚度或眼内压没有有害影响.更重要的是,Dex-SA-FFFE纳米颗粒表现出了几乎与Dexp相同体内抗炎功效,抑制房水中细胞因子(TNF-α和IL-6)的水平,表明Dex结合肽不会影响Dex的生物活性.综上所述,所提出的Dex-SA-FFFE纳米粒子可能在治疗前葡萄膜炎方面具有很大的应用价值.
葡萄膜炎,是包括了多种眼内炎症的总称,是造成发达国家失明的主要原因之一.目前发病原因尚未明确,临床上治疗葡萄膜炎的一线药是类固醇(例如,地塞米松,曲安奈德).比起全身类固醇治疗,局部类固醇治疗如滴眼液,悬浮液或软膏所引起的副反应更小,更易被患者接受.然而,由于药物在角膜前会被快速清除和角膜渗透性较差,它们的生物利用度较低.在过去的几十年里,已经提出了很多种方法,包括使用黏合剂添加剂,微/纳米技术和水凝胶化,从而延长药物在角膜前的滞留时间和增加类固醇的角膜渗透性,从而提高眼部生物利用度.最近,我们提出了可在特定PH水解的地塞米松超分子水凝胶来用于眼科药物递送.这种水凝胶结合了纳米颗粒和水凝胶的优点,自身充当"自我传送"系统,极大地增加了角膜渗透性并延长了角膜前的滞留时间.
方法:
根据先前的研究,通过使用固相合成法将二氯三苯甲基树脂和N-Fmoc保护的氨基酸合成地塞米松—肽结合物(Dex-SA-FFFE).将30毫克Dex-SA-FFFE粉末加到1毫升磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中,然后加入1mMNa2CO3溶液(相当于1摩尔Dex-SA-FFFE).将得到的悬浮液加热到95℃然后冷却到室温就可以得到Dex-SA-FFFE纳米颗粒.通过ZetasizerNanoZS-90(MalvernInstruments,Malvern,UK)来分析Dex-SA-FFFE纳米颗粒的尺寸分布和zeta电位.通过TEM(TecnaiF20,FEI,Oregon,USA)来观察Dex-SA-FFFE纳米颗粒的微观形态.在37℃的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)和含有20U/mL的猪肝脂酶的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中研究来自Dex-SA-FFFE纳米颗粒的药物(DexandDex-SA-FFFE)的体外释放曲线.为了评估Dex-SA-FFFE纳米颗粒的体外细胞毒性,我们使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测暴露于各种药物浓度后的人角膜上皮细胞系(HECE)的细胞活性.为了评估Dex-SA-FFFE纳米颗粒的体外抗炎作用,我们将用脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞置于不同的药物浓度,然后测量培养基中的炎症因子.我们研究了局部滴注了Dex-SA-FFFE纳米颗粒的健康日本大耳白兔的体内生物相容性和眼部的刺激性.我们评估了Dex-SA-FFFE纳米颗粒在内毒素诱导葡萄膜炎(EIU)兔模型中的体内抗炎作用.数据通过SPSS版本22(IBM)分析数据并表示为均值和标准差(SD).采用单因素方差分析(ANOVA)分析对照组与实验组的显著性差异,p值小于0.05有统计学意义.
结果:
在本文中,我们设计并筛选了一种用可裂解的脂键连接的Dex-SA-FFFE前体药物,它可以在药物前体浓度高达100mg/mL的水溶液中自发组装成纳米颗粒.形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒呈均匀球形,直径约为30nm.相反,DLS分析表明形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒的平均直径约为150±3.4nm,多分散指数(PDI)为0.26±0.09.形成的Dex-SA-FFFE纳米粒子带负电荷(-17.8±1.2mV),这是由于纳米颗粒表面上存在的氨基酸残基的离子化羧酸盐基团.在48小时的研究中,在PBS(pH=7.4)或含有20U/mL酯酶的PBS中,药物(Dex或Dex-SA-FFFE)几乎100%的完全从Dex-SA-FFFE纳米粒子中释放出来.培养24小时后,浓度达到1mM的Dex-SA-FFFE纳米颗粒对HCEC或L-929细胞均无毒性.与对照细胞相比,用LPS处理的RAW264.7巨噬细胞的NO,IL-6和TNF-α显著提高.与LPS组相比,0.01mM和0.1mM的Dex和Dex-SA-FFFE纳米颗粒能够显著抑制NO,IL-6和TNF-α的产生(p<0.05).然而,在测试浓度下,Dex组和Dex-SA-FFFE纳米颗粒组之间没有显著差异.在整个研究期间,使用Dex-SA-FFFE纳米颗粒治疗的眼睛没有显示任何明显的眼部刺激(如角膜水肿、结膜肿胀、晶状体混浊).荧光素钠染色显示角膜上皮层结构正常完整,无明显缺陷.结合一般观察,表面滴注Dex-SA-FFFE纳米粒子后,角膜厚度和眼压无明显变化.在兔眼玻璃体内注射内毒素24小时后,PBS组的眼睛前房中表现出严重的炎症细胞反应,而Dexp组合和Dex-SA-FFFE纳米颗粒组的眼睛表现出轻微的炎症细胞反应,前房有少量的炎性渗出物.根据临床观察,病理组织学观察提示PBS治疗眼内前房呈广泛严重的炎症浸润改变.相反,用Dexp和Dex-SA-FFFE纳米颗粒治疗的眼睛表现为很小的炎症变化,并且在前房中几乎没有炎症细胞浸润.我们注射内毒素24h后测量房水中的细胞因子TNF-α和IL-6的水平.与用PBS处理相比,Dexp和Dex-SA-FFFE纳米颗粒显著抑制房水中TNF-α和IL-6(p<0.05).
结论:
在本文中,我们提出了一种通过酯键连接的可以自组装成纳米颗粒的用于治疗前葡萄膜炎的"自我药物"传递系统的地塞米松-肽结合物(Dex-SA-FFFE)的形成.体外释放研究表明,在48h的研究中,Dex和Dex-SA-FFFE纳米颗粒在PBS或含有20u/mL酯酶的PBS中均可持续释放,PBS中酯酶的添加显著影响了释放药物中Dex/Dex-SA-FFFE的比例.体外细胞毒性试验表明,在24小时内,形成的Dex-SA-FFFE纳米颗粒药物浓度低于1mM对HCEC或L-929细胞几乎无细胞毒性.与此同时,Dex-SA-FFFE纳米颗粒显示出与Dex相当的体外抗炎功效,并显著地抑制经过LPS处理的RAW264.7巨噬细胞产生NO,IL-6和TNF-α.另一方面,形成的Dex-SA-FFFE纳米粒子在体内生物相容性试验中表现出良好的眼部耐受性,因为它们在体内生物相容性试验中对角膜厚度或眼内压没有有害影响.更重要的是,Dex-SA-FFFE纳米颗粒表现出了几乎与Dexp相同体内抗炎功效,抑制房水中细胞因子(TNF-α和IL-6)的水平,表明Dex结合肽不会影响Dex的生物活性.综上所述,所提出的Dex-SA-FFFE纳米粒子可能在治疗前葡萄膜炎方面具有很大的应用价值.