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洛氏鱥(Rhynchocypris lagowskii(Dybowski,1869))是特有的杂食性名特优经济小型鱼类,具有极高的经济价值和市场潜力,但目前洛氏鱥的养殖相对粗放,正处于大面积推广阶段,其营养需要、配套饵料、苗种繁育等人工养殖技术仍不成熟,在养殖实践过程中常常受到氧化应激的损害而生长受阻,甚至患病,进而给养殖户带来巨大经济损失。核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factorery throid 2-related factor 2,Nrf2)作为调节机体抗氧化应激中最主要的关键蛋白,当机体受到外界刺激因而处于氧化应激的状态时,Nrf2入核启动Nrf2-Keap1-ARE抗氧化信号通路,促进下游效应基因的表达,因而增强了抗氧化能力,从而保护细胞免受氧化应激的损伤。但目前该鱼在这方面的研究未见相关报道,这对该鱼的推广养殖不利。因此,解析洛氏鱥抵抗氧化应激的内在机制,加强洛氏鱥非特异性免疫研究,增强鱼体自身的免疫能力是目前解决上述产业瓶颈问题的关键。本文以洛氏鱥幼鱼(13.25±0.21)g作为该研究的试验材料,进行其Pld-Nrf2基因相关研究。首先利用RACE-PCR技术,克隆获得洛氏鱥Pld-Nrf2基因c DNA全长。其次用RT-q PCR技术手段检测洛氏鱥Pld-Nrf2基因的组织分布情况,并对所克隆的洛氏鱥Pld-Nrf2基因系统进化树、蛋白质的等电点、编码蛋白的疏水性位点、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构以及跨膜区等进行生物信息学分析。最后通过腹腔注射Nrf2的激动剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)以及Nrf2的抑制剂二氯苯并咪唑呋喃型核糖苷(DRB),通过检测相关抗氧化酶活和抗氧化物质,并采用相对q PCR技术手段,检测洛氏鱥抗氧化系统的响应,旨在验证洛氏鱥Pld-Nrf2基因的抗氧化调节功能;探索其抵抗氧化应激的生理代谢机制。本研究共包括四部分试验,结果及结论如下:1.洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2基因克隆本研究利用RACE-PCR技术首次克隆获得洛氏鱥Nrf2基因的全长序列。长度为2613 bp,从134-1900为该基因的编码区,CDS区为1767 bp。2.洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2组织表达分布及生物信息学分析通过对洛氏鱥核转录因子Pld-Nrf2全长进行了生物信息学分析,Pld-Nrf2蛋白的氨基酸数为588,ATG为起始密码子,AAC是该序列的最后一个密码子,TAG为终止密码子,开放阅读框(ORF)为1323 bp,加尾信号(AATAAA)以及Poly-A尾。蛋白质理论分子质量和等电点分别为66157.09 Da和4.60。无信号肽,SMART和CDD预测显示该蛋白含有一个BZIP结构域。Pld-Nrf2基因编码蛋白无跨膜区域,所以氨基酸都位于细胞膜表面。Pld-Nrf2基因编码的蛋白具有一定疏水性,最小疏水指数为-4.1,最大疏水指数为2.86。通过NJ法构建系统进化树进行1000子集分析,与同属的胖头鱥亲缘关系最近。实时q PCR结果表明Pld-Nrf2基因在洛氏鱥多种组织中均有表达,尤其在肝胰脏组织中表达量最高(P<0.05)。3.t BHQ对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因m RNA相对表达量的影响通过腹腔注射0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg和75 mg/kg 4个不同浓度的t BHQ溶液,在12 h、24 h、36 h、48 h分别测定抗氧化酶活和基因。结果表明,t BHQ可以显著提高血清和肝胰脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性以及总谷胱甘肽(T-GSH)含量及总抗氧化(T-AOC)水平(P<0.05),但降低丙二醛(MDA)的含量(P<0.05)。通过RT-q PCR检测技术我们检测到腹腔注射t BHQ能增加肝胰脏的Pld-Nrf2、CAT以及Cuzn-SOD m RNA的表达量(P<0.05),降低抑制蛋白Keap1 m RNA的表达量(P<0.05)。4.DRB对洛氏鱥肝胰脏抗氧化酶及抗氧化基因m RNA相对表达量的影响通过腹腔注射0 mg/kg、10 mg/kg、25 mg/kg和50 mg/kg 4个不同浓度的DRB溶液,在12 h、24 h、48 h、72 h分别测定抗氧化酶活和基因。结果表明,随着注射浓度的逐渐增大以及反应时间的积累,血清和肝胰脏中的MDA水平显著上升(P<0.05),抗氧化酶(CAT、T-SOD、及γ-GCS)活力以及抗氧化物质T-GSH含量相应下降(P<0.05),总抗氧化能力显著下降(P<0.05)。通过RT-q PCR检测技术我们检测到腹腔注射DRB能减少肝胰脏中Pld-Nrf2、Cuzn-SOD以及CAT m RNA的表达量(P<0.05),增加抑制蛋白Keap1 m RNA的表达量(P<0.05)。综上试验结果可知,通过进化树等生物信息学分析初步证明本研究所克隆得到的未知基因为洛氏鱥Pld-Nrf2;注射Nrf2促进剂t BHQ和抑制剂DRB明显的干扰了洛氏鱥的抗氧化能力,说明洛氏鱥Pld-Nrf2基因能够调节机体的抗氧化功能,从而保护洛氏鱥免受氧化损伤。