【摘 要】
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目的:研究红景天苷对脂氧合酶15B（15-lipoxygenase type B,15-LOX-2）基因缺乏引起巨噬细胞泡沫化的调节作用及其作用机制。方法:1.使用Ana-1小鼠巨噬细胞构建15-LOX-2基因缺乏表达的稳定细胞系。shRNA 沉默 Ana-1 的 15-LOX-2 基因,Ana-1-sh15-LOX-2 细胞分为 shRen（对照）、sh15-LOX-2.1252 和sh15-L
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目的:研究红景天苷对脂氧合酶15B（15-lipoxygenase type B,15-LOX-2）基因缺乏引起巨噬细胞泡沫化的调节作用及其作用机制。方法:1.使用Ana-1小鼠巨噬细胞构建15-LOX-2基因缺乏表达的稳定细胞系。shRNA 沉默 Ana-1 的 15-LOX-2 基因,Ana-1-sh15-LOX-2 细胞分为 shRen（对照）、sh15-LOX-2.1252 和sh15-LOX-2.2865 三组,每组设有三个生物学重复。分别用G418和流式细胞仪分选携带绿色荧光蛋白（GFP）的稳定细胞,蛋白印迹法（WB）验证构建的细胞中的15-LOX-2蛋白的表达情况。2.15-LOX-2缺乏对巨噬细胞功能的影响。（1）分析15-LOX-2缺乏对巨噬细胞泡沫化的影响:首先构建Ana-1-sh15-LOX-2细胞脂质吞噬模型,用油红O检测细胞吞噬脂质的情况;再用细胞膜红色荧光探针（DiI）标记细胞中的脂质,分别用荧光酶标仪和激光共聚焦显微镜在亚细胞水平上检测巨噬细胞对脂质的吞噬情况。（2）流式细胞术检测Ana-1-sh15-LOX-2细胞增殖和凋亡的变化情况。WB检测已编辑15-LOX-2的细胞中亲环素B（Cyclophilin B,CypB）蛋白和caspase3蛋白的表达情况。（3）采用RNA-seq分析Ana-1-sh15-LOX-2细胞的炎症、补体途径和TNF-α信号通路的变化;qPCR验证RNA-seq结果中炎症因子Cx3cl1、IL18、IL1α和IL1β的变化趋势。3.红景天苷对15-LOX-2缺乏的巨噬细胞的作用。用100μM红景天苷处理Ana-1-sh15-LOX-2细胞后,采用DiI染色分析细胞吞噬脂质的情况;流式细胞仪检测细胞的凋亡和增殖情况;WB检测细胞中CypB和caspase3蛋白的表达水平;qPCR检测Cx3cl1、IL18、IL1α 和 IL1β 的 mRNA 水平。结果:1.15-LOX-2基因缺乏表达的细胞系构建成功。流式细胞术的检测结果显示,Ana-1-shRNA被绿色荧光蛋白（GFP）标记上,并且shRen、sh15-LOX-2.1252和sh15-LOX-2.2865三组带GFP荧光信号的细胞比例分别平均为95.1%、91.8%和93.7%;WB结果表明15-LOX-2缺乏的巨噬细胞中15-LOX-2的表达量明显低于对照组。2.15-LOX-2缺乏诱导巨噬细胞功能紊乱。（1）由油红O染色结果得知,Ana-1-sh15-LOX-2细胞中的红染脂滴明显多于对照组;DiI进入Ana-1-sh15-LOX-2细胞与脂质结合后激发出的荧光强度明显高于对照组,说明15-LOX-2缺乏促进巨噬细胞对脂质的吞噬功能。（2）增殖和凋亡的检测结果表明,15-LOX-2缺乏的巨噬细胞的S期细胞比例明显高于对照组;早期凋亡细胞明显低于对照组。表明15-LOX-2缺乏能促进Ana-1巨噬细胞的增殖,抑制Ana-1细胞的凋亡;15-LOX-2缺乏明显增加了巨噬细胞中的CypB蛋白表达量,降低了caspase3蛋白的表达。（3）RNA-seq结果显示,15-LOX-2缺乏的Ana-1细胞中与炎症、补体途径和TNF-α信号通路相关的基因集被激活;qPCR验证结果显示Cx3cl1、IL18、IL1α和IL1β的mRNA水平升高。3.红景天苷可减轻15-LOX-2缺乏引起的巨噬细胞功能紊乱。15-LOX-2缺乏的巨噬细胞经红景天苷处理后,吞噬脂滴的量降低至正常水平;其S期细胞比例降低到与对照组接近;早期凋亡细胞比例恢复到正常水平;Ana-1-sh15-LOX-2细胞的CypB表达水平降低到正常水平;caspase3的表达量升高至与对照组的水平相近;Cx3cl1和IL18的mRNA水平降至正常水平,同时IL1α和IL1β的表达量降低了。结论:15-LOX-2缺乏可促进Ana-1巨噬细胞泡沫化进程、促进细胞的增殖以及抑制细胞的凋亡。其作用机制可能与上调CypB和减少caspase3的表达,以及激活IL18、IL1α、IL1β和Cx3cl1有关;红景天苷通过炎症通路对15-LOX-2缺乏导致的Ana-1巨噬细胞泡沫化具有调节作用,红景天苷可能对15-LOX-2异常导致的炎症相关疾病具有潜在治疗作用。
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