本文主要从以下几个部分展开：　　 第一部分 星型胶质细胞ASICs和TRPV1的表达和特性　　 目的：星型胶质细胞(astrocyte)是脑内重要的非兴奋性细胞，主要通过其细小突触包绕血管、神经元，起支持和营养作用。脑细胞受缺血、缺氧等刺激，代谢产生大量乳酸，后者导致微环境H +浓度升高。升高的H +在神经元主要激活酸敏感离子通道ASICs(acid-sensing ion channel）和/或TRPV1(transient receptor potentialV1），引起钙内流、钙超载、细胞凋亡或死亡。细胞外H +是否也能通过ASICs和/或TRPV1 影响星型胶质细胞，目前还不清楚。本文旨在通过研究ASICs 与TRPV1 在星型胶质细胞的表达及特性，为解释星型胶质细胞在低pH值环境下的高耐受性提供理论基础。　　 方法：采用全细胞膜片钳、钙影像、Western Blotting、RT-PCR和组织/细胞免疫荧光方法，观察ASICs和TRPV1 在星型胶质细胞的表达及电流特性。　　 结果：　　 1.ASICs和TRPV1 在星型胶质细胞的表达及分布　　 (1)ASICs和TRPV1 在星型胶质细胞的表达　　 提取原代培养星型胶质细胞蛋白，用western blotting 检测到ASIC1、ASIC2a、ASIC3和TRPV1 特异性蛋白条带；提取原代培养星型胶质细胞mRNA，用RT-PCR 检测到ASIC1、ASIC2和ASIC3 特异性cDNA扩增条带；用免疫荧光实验结合GFAP 标记物在大脑皮质切片(10 μm)检测到星形胶质细胞ASIC1、ASIC2a、ASIC3和TRPV1的特异性荧光。　　 (2)ASICs和TRPV1 在星型胶质细胞的分布　　 通过免疫荧光实验发现原代培养星型胶质细胞中ASIC1、ASIC2a和ASIC3均主要定位于核，而TRPV1 主要定位于胞浆/胞膜。　　 2.原代培养星型胶质细胞由pH6.0 细胞外液诱发的电流及特性　　 (1)原代培养星型胶质细胞由pH6.0 细胞外液诱发的电流　　 在电压钳模式下，形成全细胞封接，破膜后将钳制电压定为-80 mV，采用多管灌流系统，将细胞外液pH值由7.4 迅速转换为6.0，约90％细胞记录到内向性TRPV1 样电流，该电流可被TRPV1 通道特异性阻滞剂capsazepine(CPZ,30 μM)可逆性阻断，平均电流密度为39.73±6.05 pA/pF(n=13)；约10％细胞记录到内向性、快速激活的ASIC 样电流。　　 (2)原代培养星型胶质细胞由pH6.0 细胞外液诱发电流的特性　　 TRPV1 样电流具有外向整流特性，翻转电位约为+15 mV；电流pH0.5值为6.25±0.04。用NMDG +替代正常外液中Na +，TRPV1 样电流幅值显著降低，其电流密度为2.91±0.30 pA/pF(n=11，P＜0.01 vs control)；重新加入Na +，TRPV1样电流电流密度增加到58.72±5.40 pA/pF(n=10，P＜0.01 vs Na +-free current)；无钙外液(pH6.0)诱发的TRPV1 样电流密度与对照相比未见明显变化，其值为32.35±7.76 pA/pF(n=8，P>0.05 vs control)；重新换用含2 mM Ca 2+外液后，TRPV1 样电流密度为39.91±5.49 pA/pF(n=7，P>0.05 vs Ca 2+-free current)。　　 (3)原代培养星型胶质细胞由pH6.0 细胞外液诱发的胞内钙增加　　 将细胞外液pH值由7.4 迅速转换为6.0，可诱发星型胶质细胞依赖于外钙的胞内钙增加，Δ [Ca 2+]I(Δ F/F)为0.16±0.03(n=20)。与同pH值诱发的神经元胞内钙Δ [Ca 2+]I(Δ F/F)0.47±0.03(n=14)相比，其值显著降低(P＜0.01 vs neuron)。200μM ASICs 非特异性阻断剂阿米洛利和10 nM ASIC1 特异性阻断剂 PcTx1 部分阻断pH6.0 细胞外液诱发的星型胶质细胞胞内钙增加。　　 结论:　　 1.星型胶质细胞表达ASICs和TRPV1 通道。其中，ASICs 主要分布于核内，而TRPV1 主要分布于胞浆/胞膜。　　 2.在原代培养星型胶质细胞上，pH6.0的细胞外液诱发出两种电流，其中一种短暂激活而快速失活，约占10％；另一种缓慢激活、持续不失活，约占90％。这两种电流分别与神经元ASICs和TRPV1 电流相似。　　 3.星型胶质细胞TRPV1 样电流被CPZ 可逆性阻断，其对Na +的通透性大于对Ca 2+的通透性。　　 4.pH6.0 细胞外液引起的胞内钙增加由ASICs和TRPV1 共同介导。　　 第二部分 细胞外H +对内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的激活作用　　 目的：在缺血、缺氧等病理情况下，局部微环境乳酸堆积，组织间隙pH值降低，这种情况被称为乳酸酸中毒。除神经元和星型胶质细胞外，血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等也参与对酸中毒的适应性调节，其中NO及其生成酶内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）被认为是酸中毒适应性调节的关键因子，但目前血管内皮细胞eNOS/NO 参与该适应性调节的机制还不清楚，我们的研究重点在于探讨细胞外H +是否通过直接作用于eNOS 磷酸化位点(Ser1179、Ser635和Thr497)而影响eNOS 磷酸化水平，参与对血管形成的调节。　　 方法：Western Blotting，亚硝酸盐检测，血管形成实验，NH4Cl 诱导的小鼠急性代谢性酸中毒。　　 结论：　　 1.细胞外H +增加原代培养BAECs 细胞eNOS 磷酸化位点Ser1179、Ser635和Thr497的磷酸化水平，呈剂量和时间依赖关系。　　 2.NH4Cl 诱导的急性代谢性酸中毒使小鼠血浆pH值显著下降，血管内皮细胞eNOS 各磷酸化位点磷酸化水平显著升高。　　 3.细胞外H +增加血管内皮细胞NO 生成量，后者促进由eNOS 介导的HUVECs血管形成。　　 第三部分 H +感受器在酸介导的eNOS 激活过程中的作用及机制　　 目的：细胞膜H +感受器主要包括ASICs、TRPV1和H +敏感的G蛋白耦联受体。其中，前两者属于配体门控阳离子通道，主要介导Na +和Ca 2+内流。Na +参与Na+/H +和Na+/Ca 2+交换，Ca 2+通过CaMKII等激酶参与信号级联反应；后者是G蛋白耦联受体超家族中的一员，通过小G蛋白参与信号级联反应。细胞外酸化对eNOS的磷酸化调节是否由上述H +感受器介导，如果是，又是由哪种H +感受器介导的，H +感受器被激活后与eNOS之间的信号级联反应如何，是我们进一步研究的重点。　　 方法：Western Blotting　　 结论：　　 1.细胞外酸化介导的eNOS-Ser1179和Thr497 磷酸化水平升高依赖于细胞外钙。胞外Ca 2+通过TRPV1 内流，内流的Ca 2+激活CaMKII，后者进一步激活eNOSSer1179和Thr497 磷酸化位点。　　 2.细胞外酸化介导的eNOS-Ser635位点磷酸化水平升高依赖于内钙释放。IP3受体被激活，内钙释放，释放的内钙激活ERK1/2，后者进一步激活eNOS Ser635磷酸化位点。　　 总结：　　 1.星型胶质细胞表达有ASICs和TRPV1 通道，其中ASIC 主要分布在核内，TRPV1 主要分布在胞浆/胞膜。不同于神经元上的TRPV1，星型胶质细胞TRPV1对Na +的通透性大于对Ca 2+的通透性。　　 2.细胞外H +增加血管内皮细胞和血管组织eNOS-Ser1179、Thr497和Ser635位点磷酸化，促进NO 生成和血管形成。　　 3.Ser1179和Thr497位点的磷酸化由TRPV1 通道介导的胞外钙内流和胞内CaMKII 激活引起；Ser635位点的磷酸化由H +敏感的G蛋白耦联受体介导的胞内钙释放和胞内ERK1/2 激活引起。