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目的通过建立SD大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO)模型,观察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经细胞损伤及凋亡的影响,通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)和Hcy干预探讨Hcy对缺血脑组织损伤的作用机制;通过体外培养原代神经干细胞(neural stem cells,NSCs),观察Hcy对NSCs增殖及损伤的影响,通过Hcy干预及基因表达谱芯片方法探讨Hcy对NSCs增殖及损伤的作用机制。该课题旨在探讨高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)对梗塞大脑的损伤机制,为脑梗塞疾病的预防及治疗提供新的思路。方法1.80只成年雄性SD大鼠随机分为4组,分别为假手术组(sham operation,SHAM组)、大脑中动脉栓塞再灌注模型组(MCAO组)、模型+同型半胱氨酸组(MCAO+Hcy组)和模型+同型半胱氨酸+3-甲基腺嘌呤组(MCAO+Hcy+3MA组),每组20只。Hcy干预按4 m L/kg标准隔天尾静脉注射0.8 mg/m L Hcy溶液,每周称量一次体重,根据体重调整干预剂量。预干预21 d后建立MCAO模型。造模前5 d MCAO+Hcy+3MA组每天尾静脉注射3MA(5 mmol/L,4 m L/kg·d)。MCAO手术后72 h HE染色观察脑组织病理改变,TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,采用酶循环法检测大鼠血浆中Hcy浓度,透射电镜观察脑组织细胞损伤及自噬情况,免疫印迹法(Western Blot,WB)检测不同组别大鼠脑组织中的自噬标记蛋白LC3B和Beclin-1的表达情况,免疫荧光标记法(immunofluorescence,IF)检测脑组织细胞中LC3B和Beclin-1的表达及分布情况。2.取24 h内新生SD大鼠大脑分离神经干细胞(NSCs)进行原代培养。将细胞随机分成2组:正常对照组(Control组)、Hcy组(培养液中添加Hcy 150μmol/L)。免疫印迹法检测NSCs自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、m TOR、p70S6K表达情况,电镜观察NSCs损伤及自噬情况,Agilent Sure Print G3 Rat GE(8*60K,Design ID:028279)基因表达谱芯片检测NSCs基因表达谱变化,免疫印迹法验证基因芯片结果。结果1.酶循环法检测大鼠血浆发现Hcy干预组大鼠血浆Hcy浓度显著升高。HE染色发现SHAM组脑组织细胞形态正常,MCAO后细胞出现明显损伤,与MCAO组比,MCAO+Hcy组细胞损伤更为严重,MCAO+Hcy+3MA组大鼠脑组织细胞损伤程度比MCAO+Hcy组轻。TUNEL染色结果显示MCAO组神经细胞凋亡率较SHAM组高(P<0.05),而MCAO+HCY组细胞凋亡程度比MCAO组更严重(P<0.05)。与MCAO+HCY组相比,MCAO+HCY+3MA组凋亡率显著下降(P<0.05)。电镜下观察脑组织切片发现MCAO组细胞出现显著损伤,有少量自噬小体产生,与MCAO组相比,MCAO+Hcy组脑组织细胞损伤程度更严重,镜下可见更多的自噬小体。Western Blot检测结果显示:与SHAM组相比,MCAO组LC3B、Beclin-1表达上调,MCAO+HCY组LC3B、Beclin-1表达较MCAO组进一步上调,而与MCAO+HCY组相比,MCAO+Hcy+3MA组LC3B、Beclin-1表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示:LC3B(或Beclin-1)主要在皮质缺血半暗带的神经元胞浆中表达,不在星形胶质细胞中表达。MCAO组8-OHd G阳性细胞显著多于SHAM组(P<0.05)。与MCAO组比较,MCAO+Hcy组8-OHd G阳性细胞显著增加(P<0.05)。MCAO+Hcy+3MA组8-OHd G阳性细胞少于MCAO+Hcy组(P<0.05)。2.本实验成功地从新生SD大鼠大脑中分离NSCs进行培养并用Hcy干预,Western Blot检测结果发现:Hcy干预后NSCs LC3-II与LC3-I比值升高、Beclin-1表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。电镜观察结果表明:Hcy干预后细胞损伤严重,细胞内产生了很多自噬小体和自噬溶酶体。采用基因表达谱芯片对细胞m RNA的表达情况进行研究,筛选出干预后发生变异的基因457种并进行GO、pathway等相关分析,结果表明Hcy广泛影响了细胞内的多种生理、病理活动,特别是突触囊泡循环、萜类化合物的生物合成、Rap1信号通路、抗生素的生物合成、丁酸代谢、甲状腺癌、上皮细胞细菌侵入、缝隙连接等通路,其中包括m TOR通路。WB结果也验证了Hcy对m TOR通路蛋白m TOR、p70S6K的影响。结论本实验成功建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO)模型,发现Hcy加剧了缺血再灌注后神经细胞的损伤,激活了自噬,而抑制自噬能显著改善Hcy导致的自噬损伤。本研究提示Hcy可能通过激活自噬导致了脑组织的损伤。我们还发现Hcy导致的LC3B和Beclin-1的表达增加主要发生于皮层的神经元,在星形胶质细胞中几乎没有表达。说明Hcy可能通过神经元内自噬的激活造成脑组织的损伤。此外,Hcy干预后8-OHd G水平上调,故Hcy导致了脑缺血后皮质神经元自噬的过度激活,而氧化应激可能是其中的一个机制。本实验成功分离新生SD大鼠NSCs进行培养。Hcy干预结果显示:Hcy增加了NSCs的损伤和细胞内自噬水平,自噬小体增加,LC3-II/LC3-I的比值升高,Beclin-1蛋白表达增加。说明Hcy干预可能通过激活自噬造成NSCs损伤。NSCs基因芯片及WB结果显示Hcy干预影响了m TOR通路。提示Hcy干预可能通过m TOR通路激活自噬造成NSCs损伤。综上两部分结果,我们得出结论——Hcy可以通过m TOR通路激活NSCs自噬,通过ROS途径激活脑组织神经元的自噬,造成神经干细胞和神经元的损伤。