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棉铃虫是一种世界性重要害虫,棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性是与棉花安全生产密切相关的重要问题。国内外大量研究表明,细胞色素P450基因过量表达导致的解毒作用增强是棉铃虫对拟除虫菊酯产生抗性的重要机理。本文对与棉铃虫对拟除虫菊酯抗性相关的3个P450基因CYP9A12,CYP9A14和CYP9A17的基因结构和5’-端基因表达调控区进行克隆、测序和进化关系分析,为棉铃虫P450基因表达调控机制的研究奠定了一定基础。1.棉铃虫细胞色素P450 CYP9A亚家族基因组的克隆和序列分析根据已获得棉铃虫CYP9A亚家族中CYP9A12、CYPA14和CYP9A17v2的cDNA序列设计引物,在标准敏感品系SCD、拟除虫菊酯抗性品系YGF以及抗性对照品系YG中进行PCR扩增,分别获得这3个基因的全长基因组序列,利用GeneDoc软件对所获得的基因组序列进行比较分析。结果显示,基因CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2均存在9个内含子,且插入位点极其相近。已有的研究表明基因CYPA12、CYP9A14和CYP9A17v2位于同一进化分枝。推测这3个基因源于同一始祖基因,进化的机制可能是通过基因的重复拷贝以及随后的歧异。2.棉铃虫细胞色素P450基因非翻译区的克隆和序列分析细胞色素P450 CYP9A亚家族部分基因的过量表达已被证实与棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性相关。为探明棉铃虫细胞色素P450 CYP9A亚家族基因(CYP9A12、CYP9A14和CYP9A17v2)的表达调控机理,根据本实验室已获得的棉铃虫CYP9A亚家族基因全长基因组的5’-末端核苷酸序列,设计几组反向特异性引物,进行基因组步移,分别获得棉铃虫敏感品系SCD以上3个P450基因的5’-非翻译序列,再根据所获得的序列设计引物,经PCR扩增,分别获得棉铃虫拟除虫菊酯抗性品系YGF以及抗性对照品系YG的5’-非翻译区序列。通过NNPP在线分析软件分别预测出各基因的转录起始位点,并利用TFSEARCH1.3在线分析软件预测出上游启动子区域内各转录因子结合位点。通过敏感与抗性品系5’-非翻译区序列的比较,分析其差异位点,为下一步深入研究棉铃虫中细胞色素P450的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的分子机理奠定基础。3.昆虫细胞色素P450 CYP9A亚家族的基因进化根据GenBank以及相关的P450网站已提交的CYP9家族的序列,通过序列比对以及系统进化树的构建,初步确定CYP9家族源自同一个始祖基因,经基因重复以及随后的歧异进而形成功能的分化,而内含子的丢失亦是造成分化的重要原因之一。另外,利用软件对CYP9A亚家族成员的氨基酸序列进行分析、比较,结果显示CYP9A亚家族成员间具有较高的相似性,推测昆虫细胞色素P450CYP9A亚家族在代谢内生物质(蜕皮激素,脂肪酸等)以及杀虫剂、植物次生性物质等外源化合物时可能具有类似的作用机制。