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新城疫(Newcastle Disease, ND)是由副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属中的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)引起的多种禽类发生感染和死亡的一种急性、接触性传染病。目前NDV已经在世界范围内引起了四次大的流行,给养禽业造成了巨大的经济损失。本文对分离自江苏地区的20株NDV进行了囊膜糖蛋白基因(F、HN)的序列测定和遗传进化分析,根据分析结果选取部分毒株进行了生物学特性的研究。同时,为丰富基因Ⅵ型NDV的分子生物学信息,进而为深入了解基因Ⅵ型病毒的致病特性提供依据,本研究对分离到的四株鸽源基因Ⅵ型病毒进行了全基因组序列的测定及分析,并根据这些结果对鸽源基因Ⅵ型病毒的宿主特异性及毒力差异性的可能原因进行了初步探讨。1.新城疫病毒的分离鉴定及分子流行病学2007-2008年自我国江苏部分地区的发病禽群中共分离鉴定到1株鹅源、4株鸽源、1株鸵鸟源和14株鸡源NDV。应用RT-PCR技术获得了20株NDV的F基因序列,遗传进化分析表明,20株NDV中有2株基因?型、6株基因Ⅱ型、4株为基因Ⅵ型,7株基因Ⅶ型,还有一株属于class?毒株。序列相似性分析显示,两株基因?型病毒与疫苗株V4/Queensland/66的相似性最高,6株基因Ⅱ型毒株与疫苗株LaSota的相似性最高,推测为疫苗毒;7株基因Ⅶ型病毒与F48E8的相似性在90%以下,而与Ⅶd亚型病毒的相似性较高,为Ⅶd亚型;一株class?毒株与中国近年分离的毒株相似性高,而与DER49/99的相似性较低。由此看出,目前Ⅶd亚型在我国禽群中仍然十分流行,并且禽群中疫苗株带毒情况比较明显,NDV在我国的流行已呈现出多种基因型并存的状况。对HN基因整个编码区进行扩增,经克隆、测序最终获得了20株NDV的HN基因编码区序列。对其编码多肽长度进行统计分析发现,基因?型病毒编码多肽长度为585或616个,6个基因Ⅱ型病毒均为577个,4个基因Ⅵ型病毒和7个基因Ⅶ型病毒均为571个。根据HN基因编码区绘制的遗传发生树与根据F基因绘制的遗传发生树高度一致,进一步证实了NDV的演化是在基因水平上整体进行的。对基因Ⅵ型、Ⅶ型病毒进行的MDT、ICPI、IVPI的测定结果显示,基因Ⅶ型病毒的毒力与根据F基因裂解位点序列及HN基因编码多肽长度确定的毒力结果一致,而对于基因Ⅵ型病毒,两者之间存在偏差。分离株与针对NDV囊膜糖蛋白(F、HN)的单克隆抗体排谱实验结果显示:与HN蛋白单抗(6B1)不发生反应的毒株有增多的趋势。2.四株鸽源新城疫病毒全基因组序列的测定及序列分析通过RT-PCR技术对四株鸽源NDV的全基因组序列进行了扩增,经克隆、测序获得了四株病毒的全基因组序列。序列分析显示,四株病毒全长均为15192个核苷酸(nucleotide,nt),其中6碱基插入的位置与基因Ⅶ型病毒相同。根据F基因高变区绘制的遗传发生树显示,这4株病毒与1987-2002年间欧洲及日本的分离株同属于Ⅵb亚型中的EU/re(recent European,EU/re)分支,显示了这些地区在流行病学方面的相关性。根据全基因序列、F基因和HN基因分别绘制的3种遗传发生树高度一致,表明NDV的遗传演化是在全基因组水平上进行的。基因Ⅵ型与其它基因型病毒之间各蛋白氨基酸序列相似性分析显示:NDV 6个基因中P基因的变异最大,而L基因相对保守;基因Ⅵ型病毒与基因Ⅱ型病毒的相似性较低;而与基因Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ型病毒的相似性较高,这反映了基因Ⅵ型病毒与基因Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ型病毒之间在遗传进化上存在一定的相关性。对鸽源病毒与鸡源病毒各个基因编码区氨基酸序列进行比较分析发现,鸽源毒株在NP、P、L上均出现了几个特征性的氨基酸位点,分别是NP蛋白的463(N→D)、469(P→I)及477(P→H)位;P蛋白的10(D→E)、93(T-K/R)及163(R→G)位;HN蛋白的122(G→R)位;L蛋白的1110(L→T/A)及1757(A→V)位。在M、F蛋白上没有发现特异的氨基酸位点,在HN蛋白上只发现了一个(G122R)。鸽源毒株特异性氨基酸的出现可能改变了病毒相关蛋白的结构及其生物学特性,进而对其毒力和宿主特异性产生影响,相关的验证研究工作正在进行之中。