小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是三种重要的食源性致病菌,引起人和动物的食物中毒在我国非常普遍。鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)引起的鼠疫是一种严重危害人类健康的自然疫源性烈性传染病。近年来,这四种病原菌引起人畜不同类型疾病的流行有逐年加重趋势,对人类健康和畜牧业的发展造成严重威胁。鉴于上述四种病原菌对人类健康和公共卫生安全的危害性,世界各国都加强了对该类致病菌检测方法的研究。目前,xMAP液态芯片技术已被广泛应用于各研究领域,但在国内的发展还刚刚起步。本研究即采用该方法对上述4种病原菌开展多重、快速鉴别和定量检测技术的研究,以建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。该方法不仅可以为实验室研究及临床检验提供新的方法,同时对有效预防和控制感染性疾病的发生、食品安全控制、食源性疾病的监测、临床诊断及有效治疗也有着很重要的指导意义。根据GenBank发表的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对各病原菌的特异性ail、hly、cpe、3a基因设计多条长片段寡核苷酸引物,通过重叠PCR的方法获得大小分别为555 bp、591 bp、450 bp和330 bp的目的片段,将其分别克隆到pGEM-T或pMD18-T载体,然后转化宿主菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,通过序列测定分析判断目的基因是否正确插入克隆载体。针对已合成的各目的片段,分别设计1对引物和1条探针,利用构建的质粒DNA作为模板,通过单重和多重PCR对4基因进行扩增,并优化PCR反应条件,然后采用xMAP液态芯片技术进行检测。在此基础上,再进行病原菌基因组DNA的xMAP液态芯片单重和多重检测,并验证该方法的特异性和敏感性。成功构建了4种病原菌的克隆重组质粒,建立4种病原菌待检模板的多重PCR制备方法,并获得4种病原菌的特异性核酸探针。xMAP液态芯片对质粒DNA和病原菌基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内,在单管中通过一次反应,同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,敏感性高。在4种病原菌基因组DNA的单重检测中,对鼠疫耶尔森氏菌检测的灵敏度最高为30 CFU/ml;在4种病原菌基因组DNA的多重检测中,对单核细胞增生李斯特菌检测的灵敏度最高达到20 CFU/ml。实验通过初步研究,最终获得4种食源性致病菌的诊断微球,成功建立基于特异性核酸探针的多重、快速甄别和定量检测病原微生物的新方法。本研究所建立的xMAP液态芯片方法在上述4种病原菌的快速甄别和多重检测上是切实可行的,具有较高的应用价值。结果表明,该方法不仅具有多重检测、特异性和灵敏度高、重复性好的优点,同时也具有经济的进行病原诊断、样本所需量小等特点,与传统的检测方法相比具有明显的优势,因此容易被接受并值得在临床诊断中推广。xMAP液态芯片技术为病原微生物的多重快速检测提供了新方法,它也一定会成为今后生物学研究领域中一种重要的分析检测方法,具有很好的应用价值和前景。