坚粘孢单顶孢(Dactylellina haptotyla 是一种捕食器官为粘球的捕食线虫真菌。2013年,Meerupati et al.对坚粘孢单顶孢的全基因组序列进行了测定,通过与寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的全基因组序列对比发现,两株捕食线虫真菌在GC含量、基因组大小和预测的基因数目等方面都非常相似。G蛋白是真菌中普遍存在的信号调控蛋白,G蛋白信号调控因子(RGS)能够激活Ga亚基的GTP酶活性,从而调节G蛋白下游的信号途径。而MAPK是G蛋白下游信号途径的关键组分。这两种信号蛋白的功能已经在一些丝状真菌中被报道,然而在捕食线虫真菌中的功能还未见报道。本论文以坚粘孢单顶孢为研究对象,采用同源重组的方法对信号调控蛋白MAPK和RGS4的编码基因进行敲除,初步探究了 MAPK和RGS4蛋白在坚粘孢单顶孢生长发育和捕器形成过程中的作用。主要实验结果:1.MAPK和RGS4蛋白的功能保守结构域预测和聚类分析。MAPK蛋白含有415个氨基酸,预测的分子量为47.1 kDa,等电点为5.41;该蛋白含有保守的结构域Protein kinase-like domain(IPR011009)和多个保守的功能位点,如 Protein kinase,ATP binding site(IPR017441)等。RGS4 蛋白含有 1278个氨基酸,预测的分子量为142.9 kDa,等电点为6.87;该蛋白除了含有保守的RGS domain(IPR016137),还含有 Phox-associated domain(IPR003114),Phox homologous domain(IPR001683)和 sorting nexin,C-terminal(IPR013937)保守的结构域。聚类分析表明,坚粘孢单顶孢的MAPK和RGS4蛋白与其它丝状真菌来源的同源蛋白亲缘关系相对较远。2.构建敲除载体、转化原生质体及筛选阳性转化子。采用酵母法构建载体,得到阳性酵母转化子,将敲除全长片段导入坚粘孢单顶孢原生质体中,得到阳性转化子。通过PCR以及Southern blot验证之后,分别获得Mapk和Rgs4基因的敲除突变菌株。3.敲除菌株和野生型菌株的表型比较。对敲除株和野生株进行捕器形成、产孢、生长速率和抗逆性等方面的对比实验,实验结果表明,MAPK蛋白参与了坚粘孢单顶孢的捕器形成、产孢、菌丝生长以及抗逆性等生物学表型的调控,对捕器的形成、产孢数量及抗逆性的影响很大,其敲除株没有捕器和分生孢子产生;而RGS4蛋白参与了捕器形成和产孢等表型的调控,对菌丝生长和抗逆性的影响不大,其敲除株的产孢数量和捕食器官形成数量明显下降。本论文的创新性:敲除了坚粘孢单顶孢中的Mapk和Rgs4基因,对野生菌株和敲除突变株在捕器形成、产孢数量、抗逆性和生长速率等生物学表型进行了较系统的比较,初步推测了 MAPK和RGS4蛋白在坚粘孢单顶孢生长和发育中的功能。