【摘 要】
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胚胎干细胞有独特的能力,能自我更新,无限增殖,并分化或发育成多种类型的细胞和组织。胚胎干细胞应用到临床领域的关键问题是如何从其他类型的细胞中鉴定和分离出ES细胞。作为细胞的“身份证”,特异标志分子在胚胎干细胞识别和确定中发挥了重要作用。本论文中将从噬菌体肽库中筛选出的针对猕猴胚胎干细胞的特异多肽的DNA序列连接到pGEX-KG表达载体上,以便获得GST-peptides融合蛋白。同时,抽提大量培养
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胚胎干细胞有独特的能力,能自我更新,无限增殖,并分化或发育成多种类型的细胞和组织。胚胎干细胞应用到临床领域的关键问题是如何从其他类型的细胞中鉴定和分离出ES细胞。作为细胞的“身份证”,特异标志分子在胚胎干细胞识别和确定中发挥了重要作用。本论文中将从噬菌体肽库中筛选出的针对猕猴胚胎干细胞的特异多肽的DNA序列连接到pGEX-KG表达载体上,以便获得GST-peptides融合蛋白。同时,抽提大量培养的猕猴胚胎干细胞RS366.4获得它的膜蛋白,然后利用GST pull-down技术来研究GST-peptide与膜蛋白之间的特异相互作用。本论文的研究成功构建了稳定的GST表达系统,建立稳定的GST-peptide纯化体系,并获得一定数量的RS366.4猕猴胚胎干细胞膜上靶分子受体的蛋白序列信息,以便后续对受体功能更加深入的研究。在构建GST-peptide表达载体时,提出了一种快速构建表达载体的新方法。利用小片段基因寡聚核苷酸合成技术和竞争性连接原理,成功的构建了5个GST-peptide表达载体,分别为p-APW, p-HGE, p-GYP, p-TPL, p-SLH。在表达条件摸索时,发现最佳诱导表达时间是4小时,而且这些融合蛋白均为可溶性高表达。最后Western blot鉴定了这些融合蛋白均为带GST标签的蛋白。GST-peptides在后续试验中作为诱饵蛋白。同时,培养了大量的（约2.0x107）RS366.4猕猴胚胎干细胞。对这些细胞进行了碱性磷酸酶的检测以及胚胎干细胞特异性基因的RT-PCR,结果显示是强阳性,说明这些细胞还处于未分化状态。最后在温和的条件下,抽提了这些细胞的膜蛋白,以便后续实验中用作靶蛋白。通过GST pull-down方法,研究了GST-peptides和RS366.4、PMEF膜蛋白之间的相互作用,SDS-PAGE鉴定分析发现了GST-APW和GST-HGE能与特异的膜蛋白有相互作用,而与PMEF细胞膜蛋白没有相互作用。MALDI-TOF-MS测序和分析得出,在与GST-APW相互作用的可能蛋白中,这两个蛋白,分别为opalin isoform c [Homo sapiens]和PREDICTED:opalin-like [Callithrix jacchus],是同源性蛋白,而且是跨膜蛋白。在与GST-HGE相互作用的可能蛋白中,unnamed protein product [Macaca fascicularis]是一个未命名蛋白,而且是属于猕猴属的,很有可能是GST-HGE的膜受体分子。
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