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【目的】
1.建立BALB/c小鼠巨细胞病毒播散性感染模型，测定肝脏组织自噬相关蛋白LC3-II及p62表达水平，明确MCMV感染能否影响肝脏组织自噬状态；
2.在整体水平观察不同自噬状态对MCMV感染所致肝脏组织病理损伤程度、炎症因子表达水平以及MCMV病毒复制载量的影响，探讨自噬在MCMV感染所致肝脏损伤及宿主抗病毒免疫反应中的作用及其机制，期望能为阐明HCMV致病机制提供一些新的实验依据。
【方法】
1.BALB/c小鼠MCMV播散性感染模型的建立：将4周龄SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为正常对照组(Mock)和MCMV感染组(MCMV)。正常对照组小鼠腹腔注射DMEM培养基200μl/只，MCMV感染组小鼠腹腔注射MCMVSmith毒株1.0×104PFU/只(200μl)；于建模后1、3、7、14和21天，采用乙醚麻醉后颈椎脱臼法每组分别随机处死3只小鼠，无菌留取肝脏组织及外周血；
2.自噬干预小鼠模型的建立：将4周龄SPF级BALB/c雌性小鼠随机分成3天组和7天组，其中，每组再分成6个亚组，分别为：①正常对照组(Mock)；②MCMV感染组(MCMV)；③正常对照+饥饿组(mock+starvation，Mock+S)；④MCMV感染+饥饿组(MCMVinfection+starvation，MCMV+S)；⑤正常对照+氯喹组(mock+chloroquine，Mock+CQ)；⑥MCMV感染+氯喹组(MCMVinfection+chloroquine，Mock+CQ)。模拟感染和MCMV感染方法同上。3天组和7天组分别于建模后24小时和120小时开始给予自噬干预处理：增强自噬采用取样前48小时饥饿法；抑制自噬采用腹腔注射氯喹，剂量为每次100mg/kg，溶解于100μlPBS中，于取样前48小时、24小时和4小时给予3剂。分别于建模后3天和7天采用乙醚麻醉后颈椎脱臼法每组随机处死3只小鼠，无菌留取肝脏组织及外周血；
3.肝脏组织病理改变：收集各实验组小鼠肝脏组织标本，制备肝脏组织切片，经HE染色后，对肝脏组织的病理损伤程度进行评估，并根据Knodell肝组织病变活动性积分(HAI)对肝脏的病理损伤程度进行评分；
4.血清AST和ALT水平：微板法检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，以评估肝脏功能；
5.肝脏组织炎症因子转录水平：提取各实验组肝脏组织RNA，逆转录获取cDNA，利用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肝脏内促炎细胞因子IL-1β和抗病毒细胞因子IFN-α的mRNA转录水平；
6.肝脏组织MCMV病毒载量：利用实时荧光定量PCR法检测各实验组小鼠肝脏中MCMV病毒蛋白gBmRNA转录水平，对肝脏病毒载量进行评估；
7.肝脏组织自噬水平：利用蛋白印迹法检测各实验组肝脏组织中自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、p62、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平的动态变化。
【结果】
1.MCMV播散性感染模型小鼠肝脏病变与自噬
(1)肝脏组织病理改变：与正常对照组相比，感染组小鼠肝脏组织于感染后第1天出现炎症细胞浸润，第7天最为严重，第14天明显改善，但肝脏损伤一直持续至第21天；肝脏HAI评分与病理损伤变化趋势一致。
(2)血清AST和ALT变化：感染组小鼠血清AST水平从感染后第1天开始升高，第7天时达到峰值，至第14天恢复正常；而ALT升高稍晚于AST，但也在第7天达到峰值，并于第21天恢复到正常水平。对照组小鼠血清AST及ALT水平一直基本稳定。
(3)炎症因子IL-1β和IFN-α转录水平：感染组小鼠肝脏组织中IL-1β和IFN-α的mRNA水平在感染后第1天开始升高，在第7天均达到最高峰，随后开始下降，在感染后第14天时，IL-1β转录水平已下降至感染后第1天水平，而IFN-α转录水平仍显著高于感染后第1天水平(P＜0.01)，直到感染后第21天时两者均恢复至正常水平。且IL-1β转录水平与肝脏组织病理性损伤程度(HAI评分)呈显著正相关(R=0.959，P＜0.01)。
(4)肝脏组织MCMV病毒载量：感染组小鼠肝脏内病毒蛋白gB的mRNA转录水平在感染后第3天达到最高，在感染后第7天时显著下降，感染21天时已检测不到gBmRNA。
(5)肝脏组织自噬水平：与正常对照组相比，感染组小鼠在感染MCMV后第3天和第7天肝脏组织LC3-II蛋白表达降低(P＜0.05)，而p62表达升高(P＜0.01)，而在感染后第1、14、21天两组之间LC3-II和p62蛋白表达水平无统计学差异，即MCMV感染后第3天及第7天肝脏自噬处于抑制状态。
2.饥饿诱导增强自噬对MCMV播散性感染小鼠肝脏病变的影响
(1)肝脏中病毒蛋白gBmRNA载量增高：与未给予自噬干预的感染组(MCMV组)相比，在诱导自噬干预下，感染后第3天和第7天，MCMV+S组小鼠肝脏中MCMVgBmRNA水平均明显升高(P＜0.05)。
(2)肝脏组织病理损伤程度加重：感染后第3天和第7天，与相应MCMV组相比，MCMV+S组的肝脏病理损害更为严重，HAI评分增高(P＜0.01)。
(3)血清AST和ALT水平增高：感染后第3天和第7天，MCMV+S组的AST和ALT水平均高于相应MCMV组(P＜0.05)。
(4)肝组织IL-1β高表达和IFN-α低表达：感染后第3天和第7天，MCMV+S组的促炎性细胞因子IL-1β表达水平高于相应MCMV组(P＜0.05)，然而抗病毒细胞因子IFN-α的表达却低于相应MCMV组(P＜0.05)。
3.氯喹处理抑制自噬对MCMV播散性感染小鼠肝脏病变的影响
(1)肝脏中病毒蛋白gBmRNA载量降低：与未给予自噬干预的感染组(MCMV组)相比，在氯喹抑制自噬的干预下，感染后第3天和第7天，MCMV+CQ组小鼠肝脏MCMVgBmRNA水平明显降低(P＜0.05)。
(2)肝脏组织的病理损伤程度减轻：与MCMV组相比，MCMV+CQ组在感染后第3天，肝脏的病变程度减轻，HAI评分降低(P＜0.05)。但是在MCMV感染后第7天两组间肝脏的病理损伤程度并没有明显差别。
(3)血清AST和ALT水平降低：MCMV感染后第3天，MCMV+CQ组的AST和ALT水平均低于MCMV组(P＜0.05)。在MCMV感染后第7天，MCMV+CQ组的ALT水平仍低于MCMV组，但两组间AST水平无统计学差异。
(4)肝组织IL-1β低表达和IFN-α高表达：在感染后第3天，MCMV+CQ组IL-1β表达水平低于MCMV组(P＜0.01)，而IFN-α表达水平却高于MCMV组(P＜0.01)。在感染后第7天，两组间IL-1β和IFN-α表达水平均无统计学差异。
4.PI3K/Akt/mTOR信号通路改变：感染后第3天和第7天肝脏组织中PI3K表达水平、p-Akt/Akt比值和p-mTOR/mTOR比值：Mock+S组均低于Mock组(P＜0.05)，Mock+CQ组均高于Mock组(P＜0.05)，MCMV组均高于Mock组(P＜0.05)；而MCMV+S组均高于Mock+S组(P＜0.05)，MCMV+CQ组则与Mock+CQ组及MCMV组之间均无统计学差异，但仍高于Mock组(P＜0.05)。
【结论】
1.MCMV感染诱导肝组织内促炎因子过度激活与病毒复制共同参与播散性MCMV感染BALB/c小鼠肝脏病理损伤过程，急性感染早期以病毒复制占主导，中期二者同时存在，晚期以炎症损伤为主。
2.BALB/c小鼠在MCMV感染后3～7天肝脏组织自噬处于抑制状态，后者可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活有关，是宿主组织细胞与感染病毒相互作用的结局。
3.自噬可通过上调肝组织促炎因子IL-1β表达和促进病毒复制参与MCMV感染所致肝损伤；而抑制自噬则可使IL-1β低表达，IFN-α高表达，减少病毒复制，在一定程度上减轻MCMV感染所致肝脏炎症反应和病理损伤。
1.建立BALB/c小鼠巨细胞病毒播散性感染模型，测定肝脏组织自噬相关蛋白LC3-II及p62表达水平，明确MCMV感染能否影响肝脏组织自噬状态；
2.在整体水平观察不同自噬状态对MCMV感染所致肝脏组织病理损伤程度、炎症因子表达水平以及MCMV病毒复制载量的影响，探讨自噬在MCMV感染所致肝脏损伤及宿主抗病毒免疫反应中的作用及其机制，期望能为阐明HCMV致病机制提供一些新的实验依据。
【方法】
1.BALB/c小鼠MCMV播散性感染模型的建立：将4周龄SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为正常对照组(Mock)和MCMV感染组(MCMV)。正常对照组小鼠腹腔注射DMEM培养基200μl/只，MCMV感染组小鼠腹腔注射MCMVSmith毒株1.0×104PFU/只(200μl)；于建模后1、3、7、14和21天，采用乙醚麻醉后颈椎脱臼法每组分别随机处死3只小鼠，无菌留取肝脏组织及外周血；
2.自噬干预小鼠模型的建立：将4周龄SPF级BALB/c雌性小鼠随机分成3天组和7天组，其中，每组再分成6个亚组，分别为：①正常对照组(Mock)；②MCMV感染组(MCMV)；③正常对照+饥饿组(mock+starvation，Mock+S)；④MCMV感染+饥饿组(MCMVinfection+starvation，MCMV+S)；⑤正常对照+氯喹组(mock+chloroquine，Mock+CQ)；⑥MCMV感染+氯喹组(MCMVinfection+chloroquine，Mock+CQ)。模拟感染和MCMV感染方法同上。3天组和7天组分别于建模后24小时和120小时开始给予自噬干预处理：增强自噬采用取样前48小时饥饿法；抑制自噬采用腹腔注射氯喹，剂量为每次100mg/kg，溶解于100μlPBS中，于取样前48小时、24小时和4小时给予3剂。分别于建模后3天和7天采用乙醚麻醉后颈椎脱臼法每组随机处死3只小鼠，无菌留取肝脏组织及外周血；
3.肝脏组织病理改变：收集各实验组小鼠肝脏组织标本，制备肝脏组织切片，经HE染色后，对肝脏组织的病理损伤程度进行评估，并根据Knodell肝组织病变活动性积分(HAI)对肝脏的病理损伤程度进行评分；
4.血清AST和ALT水平：微板法检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平，以评估肝脏功能；
5.肝脏组织炎症因子转录水平：提取各实验组肝脏组织RNA，逆转录获取cDNA，利用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肝脏内促炎细胞因子IL-1β和抗病毒细胞因子IFN-α的mRNA转录水平；
6.肝脏组织MCMV病毒载量：利用实时荧光定量PCR法检测各实验组小鼠肝脏中MCMV病毒蛋白gBmRNA转录水平，对肝脏病毒载量进行评估；
7.肝脏组织自噬水平：利用蛋白印迹法检测各实验组肝脏组织中自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II、p62、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平的动态变化。
【结果】
1.MCMV播散性感染模型小鼠肝脏病变与自噬
(1)肝脏组织病理改变：与正常对照组相比，感染组小鼠肝脏组织于感染后第1天出现炎症细胞浸润，第7天最为严重，第14天明显改善，但肝脏损伤一直持续至第21天；肝脏HAI评分与病理损伤变化趋势一致。
(2)血清AST和ALT变化：感染组小鼠血清AST水平从感染后第1天开始升高，第7天时达到峰值，至第14天恢复正常；而ALT升高稍晚于AST，但也在第7天达到峰值，并于第21天恢复到正常水平。对照组小鼠血清AST及ALT水平一直基本稳定。
(3)炎症因子IL-1β和IFN-α转录水平：感染组小鼠肝脏组织中IL-1β和IFN-α的mRNA水平在感染后第1天开始升高，在第7天均达到最高峰，随后开始下降，在感染后第14天时，IL-1β转录水平已下降至感染后第1天水平，而IFN-α转录水平仍显著高于感染后第1天水平(P＜0.01)，直到感染后第21天时两者均恢复至正常水平。且IL-1β转录水平与肝脏组织病理性损伤程度(HAI评分)呈显著正相关(R=0.959，P＜0.01)。
(4)肝脏组织MCMV病毒载量：感染组小鼠肝脏内病毒蛋白gB的mRNA转录水平在感染后第3天达到最高，在感染后第7天时显著下降，感染21天时已检测不到gBmRNA。
(5)肝脏组织自噬水平：与正常对照组相比，感染组小鼠在感染MCMV后第3天和第7天肝脏组织LC3-II蛋白表达降低(P＜0.05)，而p62表达升高(P＜0.01)，而在感染后第1、14、21天两组之间LC3-II和p62蛋白表达水平无统计学差异，即MCMV感染后第3天及第7天肝脏自噬处于抑制状态。
2.饥饿诱导增强自噬对MCMV播散性感染小鼠肝脏病变的影响
(1)肝脏中病毒蛋白gBmRNA载量增高：与未给予自噬干预的感染组(MCMV组)相比，在诱导自噬干预下，感染后第3天和第7天，MCMV+S组小鼠肝脏中MCMVgBmRNA水平均明显升高(P＜0.05)。
(2)肝脏组织病理损伤程度加重：感染后第3天和第7天，与相应MCMV组相比，MCMV+S组的肝脏病理损害更为严重，HAI评分增高(P＜0.01)。
(3)血清AST和ALT水平增高：感染后第3天和第7天，MCMV+S组的AST和ALT水平均高于相应MCMV组(P＜0.05)。
(4)肝组织IL-1β高表达和IFN-α低表达：感染后第3天和第7天，MCMV+S组的促炎性细胞因子IL-1β表达水平高于相应MCMV组(P＜0.05)，然而抗病毒细胞因子IFN-α的表达却低于相应MCMV组(P＜0.05)。
3.氯喹处理抑制自噬对MCMV播散性感染小鼠肝脏病变的影响
(1)肝脏中病毒蛋白gBmRNA载量降低：与未给予自噬干预的感染组(MCMV组)相比，在氯喹抑制自噬的干预下，感染后第3天和第7天，MCMV+CQ组小鼠肝脏MCMVgBmRNA水平明显降低(P＜0.05)。
(2)肝脏组织的病理损伤程度减轻：与MCMV组相比，MCMV+CQ组在感染后第3天，肝脏的病变程度减轻，HAI评分降低(P＜0.05)。但是在MCMV感染后第7天两组间肝脏的病理损伤程度并没有明显差别。
(3)血清AST和ALT水平降低：MCMV感染后第3天，MCMV+CQ组的AST和ALT水平均低于MCMV组(P＜0.05)。在MCMV感染后第7天，MCMV+CQ组的ALT水平仍低于MCMV组，但两组间AST水平无统计学差异。
(4)肝组织IL-1β低表达和IFN-α高表达：在感染后第3天，MCMV+CQ组IL-1β表达水平低于MCMV组(P＜0.01)，而IFN-α表达水平却高于MCMV组(P＜0.01)。在感染后第7天，两组间IL-1β和IFN-α表达水平均无统计学差异。
4.PI3K/Akt/mTOR信号通路改变：感染后第3天和第7天肝脏组织中PI3K表达水平、p-Akt/Akt比值和p-mTOR/mTOR比值：Mock+S组均低于Mock组(P＜0.05)，Mock+CQ组均高于Mock组(P＜0.05)，MCMV组均高于Mock组(P＜0.05)；而MCMV+S组均高于Mock+S组(P＜0.05)，MCMV+CQ组则与Mock+CQ组及MCMV组之间均无统计学差异，但仍高于Mock组(P＜0.05)。
【结论】
1.MCMV感染诱导肝组织内促炎因子过度激活与病毒复制共同参与播散性MCMV感染BALB/c小鼠肝脏病理损伤过程，急性感染早期以病毒复制占主导，中期二者同时存在，晚期以炎症损伤为主。
2.BALB/c小鼠在MCMV感染后3～7天肝脏组织自噬处于抑制状态，后者可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活有关，是宿主组织细胞与感染病毒相互作用的结局。
3.自噬可通过上调肝组织促炎因子IL-1β表达和促进病毒复制参与MCMV感染所致肝损伤；而抑制自噬则可使IL-1β低表达，IFN-α高表达，减少病毒复制，在一定程度上减轻MCMV感染所致肝脏炎症反应和病理损伤。