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研究目的近年来成人肥胖(BMI≥30kg/m~2)的发病率持续上升,并逐渐成为一个全球问题。流行病学研究发现肥胖与一系列慢性疾病相关,如糖尿病,心血管疾病,癌症等,全球每年约有400万人口死于肥胖相关的疾病。因此,研究和认识肥胖可能存在的机制对于预防和治疗肥胖以及其相关疾病存在重要的意义。我们前期的群体遗传学研究发现,Rac1通路与血浆脂联素水平显著相关,但其生物学机制尚不明确。RAC1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)是RHO家族中一种小GTP结合蛋白,在细胞内RAC1以活性的GTP结合状态和非活性GDP结合状态两种形式存在,这两种形态相互转化,发挥其生物学功能。当RAC1与GTP结合状态时将结合多种效应蛋白以调节细胞反应,例如分泌过程,凋亡细胞的吞噬作用,上皮细胞极化,神经元粘附,迁移和分化,糖摄取以及生长因子诱导的膜褶皱形成等。但RAC1是否直接影响脂肪细胞的分化、其作用环节如何?尚有待进一步研究。本课题的目的是研究RAC1对脂肪前体细胞(3T3-L1)分化成熟和脂肪积累的影响,并通过转录组学分析,探究其中可能的分子机制。方法及内容本研究以3T3-L1细胞模型为研究对象,利用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),地塞米松(DXMS)和胰岛素诱导3T3-L1细胞向成熟的脂肪细胞分化,在此过程中我们利用Rac1干扰RNA(siRNA)抑制RAC1蛋白的表达、利用Rac1过表达质粒载体促进RAC1蛋白的表达、并以RAC1小分子抑制剂EHT1864影响RAC1的功能,以观察RAC1脂肪前体细胞分化的影响。诱导分化6天后利用油红O染料对细胞进行染色观察Rac1 siRNA、Rac1过表达质粒载体以及小分子抑制剂EHT1864对细胞分化的影响;利用Western Blotting技术检测脂肪细胞高表达蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和脂联素(adiponectin,ADPN)的表达水平;利用甘油三酯定量试剂盒检测细胞中甘油三酯的含量;利用葡萄糖含量检测试剂盒检测培养基中葡萄糖残余量;利用实时定量PCR技术检测细胞中Rac1,PPAR-γmRNA的表达水平;将3T3L-1细胞空白对照组和20μM EHT1864处理组RNA样品以Illumin Hiseq 4000测序平台进行全转录组测序(RNA-Sequencing),将测序结果得到的数据进行GO、Reactome和KEGG的通路富集分析。研究结果1.油红O染色和甘油三酯定量检测结果显示,RAC1抑制剂EHT1864或Rac1的siRNA作用于被诱导分化过程中3T3-L1细胞时,可以促进脂肪前体细胞分化;Rac1过表达质粒作用于被诱导分化过程中3T3-L1细胞时,可以抑制脂肪前体细胞分化。2.实时定量PCR结果表明,RAC1抑制剂EHT1864作用于被诱导分化过程中的3T3-L1细胞时,细胞中的PPAR-γmRNA水平明显上升,Rac1 mRNA水平变化不明显。3.Western Blotting结果表明,RAC1抑制剂EHT1864作用于被诱导分化成熟3T3-L1细胞时细胞中的PPAR-γ,ADPN蛋白水平明显上升,RAC1蛋白水平明显下降。Rac1的siRNA作用于被诱导分化过程中3T3-L1细胞时,被诱导分化成熟3T3-L1细胞时细胞中的PPAR-γ、ADPN蛋白水平明显上升,RAC1蛋白水平明显下降。利用Rac1过表达质粒促进诱导分化过程中的3T3-L1细胞表达RAC1蛋白,细胞中的PPAR-γ、ADPN蛋白水平明显下降。4.全转录组图谱结果表明,20μM EHT1864处理诱导分化成熟过程中的3T3-L1细胞6天后共有3541个基因出现表达差异,其中上调的基因有1940个,下调的基因有1601个。KEGG通路富集表明,当RAC1的功能被EHT1864抑制后,可影响糖异生/糖酵解、非酒精性脂肪肝、PPAR-γ、丙酮酸代谢、三羧酸循环(TCA循环)等与细胞糖代谢,脂肪生成相关的信号通路。GO和Reactome富集结果显示,在EHT1864的作用下,3T3-L1细胞在分化成熟过程中的差异表达基因在各类脂肪酸的代谢、氧化磷酸化、糖异生等相关的生化过程中富集。结论1.利用siRNA、RAC1小分子抑制剂EHT1864以及Rac1过表达质粒调节脂肪前体细胞中的RAC1表达量或功能会直接影响脂肪细胞的分化,其中抑制RAC1可以促进脂肪前体细胞的分化,RAC1过表达则会抑制脂肪细胞的分化。2.转录组分析结果分析表明,EHT1864可使脂肪细胞分化相关的基因表达上调,并可能通过调节细胞内与脂代谢和糖代谢相关的基因来影响脂肪前体细胞的分化。