下丘脑弓状核miR-98-5p调控α7nAchR参与大鼠三叉神经痛的作用机制研究

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目的:通过生物信息学软件targetscan筛选出与α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAchR)mRNA 存在结合位点的 miR-98-5p,研究miR-98-5p与α7nAchR在三叉神经痛(Trigeminal neuralgia,TN)大鼠下丘脑弓状核(Hypothalamic arcuate nucleus,ARC)内表达以及二者的靶向关系,并探讨组蛋白修饰如何调控miR-98-5p表达以及后者通过靶向调控α7nAchR参与三叉神经痛调节,目的是在基因水平找寻治疗三叉神经痛的新靶点,为研发新药提供实验依据。方法:(1)以成年雄性SD大鼠作为实验对象,通过结扎一侧眶下神经制作大鼠三叉神经痛模型(Chronic constrictive injury to the infraorbital nerve,CCI-ION),并在手术后第7天、第14天、第21天、第28天用von Frey检测各组大鼠术侧须垫部的机械痛阈值。(2)通过免疫印迹(Western blot)检测各个时间点CCI-ION大鼠ARC内α7nAchR蛋白的表达变化;免疫荧光(Immunofluorescence)染色确定大鼠ARC内α7nAchR的分布情况。(3)通过ARC微量注射α7nAchR激动剂PNU282987,观察CCI-ION大鼠的痛行为变化。(4)通过生物信息预测软件targetscan筛选出能够与α7nAchR mRNA结合的microRNA(miR-98-5p);PCR验证miR-98-5p是否在大鼠ARC内表达;原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)验证 miR-98-5p 是否与 α7nAchR 共表达。(5)通过实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR)检测不同时间点CCI-ION大鼠ARC内miR-98-5p、α7nAchR mRNA的表达变化,并分析两者的相关性;双荧光酶报告基因(Dual-luciferase reporter assays)验证miR-98-5p能否调控 α7nAchR mRNA。(6)通过CCI-ION大鼠ARC微量注射miR-98-5p antagomir,检测下调miR-98-5p对大鼠痛行为以及α7nAchR蛋白表达的影响;通过正常大鼠ARC微量注射miR-98-5p agomir,检测上调miR-98-5p对大鼠痛行为以及α7nAchR蛋白表达的影响。(7)通过免疫印迹(Western blot)检测CCI-ION大鼠ARC内组蛋白H3K18乙酰化程度;染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)检测CCI-ION大鼠ARC内组蛋白H3K18ac与miR-98-5p基因启动子区域的结合情况。结果:(1)在造模后第14天,CCI-ION大鼠机械痛阈值显著降低,并且一直持续到第28天,与对照组相比,有显著的统计学意义(p<0.001)。(2)CCI-ION大鼠ARC内α7nAchR蛋白表达显著降低,并且一直持续到第28天,与对照组相比,有显著的统计学意义(p<0.05);ARC微量注射α7nAchR激动剂PNU282987(剂量1 μL,浓度0.1 mM)能够显著提高CCI-ION大鼠机械痛阈值(p<0.05),即缓解大鼠机械痛而产生镇痛作用。(3)免疫荧光染色结果显示,ARC内α7nAchR主要表达在神经元,星形胶质细胞、小胶质细胞中很少表达。(4)通过生物信息学软件targetscan筛选出miR-98-5p与α7nAchR mRNA存在结合位点;PCR结果显示大鼠ARC内存在miR-98-5p;FISH结果表明miR-98-5p与α7nAchR在ARC中共表达;qPCR结果显示在CCI-ION大鼠ARC内miR-98-5p表达显著升高(p<0.01),而α7nAchR mRNA表达显著降低(p<0.01),两者表达呈负相关(p<0.05);并且双荧光素酶报告基因结果表明miR-98-5p能够调控α7nAchR。(5)在 CCI-ION 大鼠 ARC 微量注射 miR-98-5p antagomir 可致 α7nAchR 蛋白表达升高(p<0.05),同时能缓解大鼠机械痛敏(p<0.01);而在正常大鼠ARC微量注射miR-98-5p agomir可致α7nAchR蛋白表达降低(p<0.01),导致大鼠出现机械痛敏(p<0.05)。(6)免疫印迹结果表明CCI-ION大鼠ARC内组蛋白H3K18乙酰化程度显著升高(p<0.05);染色质免疫共沉淀结果表明CCI-ION大鼠ARC内miR-98-5p基因启动子区域募集的组蛋白H3K18ac显著增多(p<0.05),即组蛋白乙酰化促进miR-98-5p基因的表达。结论:大鼠下丘脑弓状核内组蛋白乙酰化修饰的miR-98-5p可通过负性靶向调控α7nAchR表达参与三叉神经痛调节,提示miR-98-5p可作为治疗三叉神经痛的新靶点。
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