目的:宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,已严重威胁女性群体健康。中药蔓荆子始载于《神农本草经》,能疏散风热、清利头目,其提取物及其单体均具有良好的抗肿瘤活性。课题组前期发现蔓荆子活性成分蔓荆呋喃对宫颈癌细胞具有良好的抑制作用,本论文在此基础上评估蔓荆呋喃诱导宫颈癌细胞凋亡作用,并验证其作用靶点和下游信号通路,为后续研究提供实验数据。方法:1、用95%乙醇回流提取蔓荆子,对其馏分进行不断分离,得到的结晶粉末采用薄层色谱及高效液相进行纯度分析,最后用质谱碳谱氢谱进行结构鉴定。2、采用CCK-8实验观察蔓荆呋喃对宫颈癌He La和Si Ha细胞活力的影响。3、采用DAPI和JC-1染色实验分析蔓荆呋喃对宫颈癌He La和Si Ha细胞形态及线粒体膜电位的影响。4、采用流式细胞术检测蔓荆呋喃对宫颈癌He La和Si Ha细胞周期及凋亡的影响。5、采用非标记定量蛋白质组学方法,筛选蔓荆呋喃诱导He La细胞凋亡的差异蛋白以及进行聚类分析和通路分析。6、采用WB实验检测PI3K/AKT以及MAPK信号通路相关蛋白,评估这两种通路在蔓荆呋喃诱导He La细胞凋亡中的作用。7、采用WB实验检测在蔓荆呋喃作用下,He La细胞内线粒体通路凋亡相关蛋白的表达水平。这些蛋白包括:Apaf-1、cleaved-PARP、cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 8、cleaved-Caspase 9、Bax、Bcl-2、Bcl-x L和Bim。8、采用DARTS联合质谱技术,结合蛋白质组学分析结果,初步筛选蔓荆呋喃诱导He La细胞凋亡的候选蛋白,并对其进行验证。首先在不同浓度蔓荆呋喃作用下检测候选蛋白在He La细胞中的表达水平;通过DARTS,在不同Pronase与蛋白量的比例下,进行WB检测,验证是否为蔓荆呋喃诱导宫颈癌细胞凋亡的靶蛋白。9、通过CETSA技术,在不同温度作用下,进行WB检测,验证是否为蔓荆呋喃诱导宫颈癌细胞凋亡的靶蛋白。10、采用MST技术,检测蔓荆呋喃与靶蛋白之间的结合亲和力,进一步验证结合靶点。11、采用分子对接技术,分析蔓荆呋喃与靶蛋白之间的结合位点。12、建立He La细胞皮下荷瘤小鼠模型,当移植瘤体积达75 mm~3时,将小鼠进行随机分组:溶剂对照组,40 mg/kg蔓荆呋喃组以及顺铂组,定期进行腹腔注射给药10天。停药观察5天后处死小鼠,解剖肿瘤称重,评估蔓荆呋喃是否影响小鼠体内移植瘤生长。结果:1、蔓荆子中提取分离得到的白色粉末为单一化合物,纯度为99.49%,质谱碳谱氢谱分析表明该化合物的分子式为C22H34O4,分子量为362.51。2、不同浓度蔓荆呋喃作用宫颈癌He La、Si Ha细胞后,细胞明显受到不同程度抑制,并且存在时间与剂量依赖性。药物作用He La细胞的IC50（24 h）为8.64±0.30μM,IC50（48 h）为6.42±0.24μM;药物作用Si Ha细胞IC50（24 h）为7.22±0.15μM,IC50（48 h）为5.33±0.28μM。3、DAPI染色发现在蔓荆呋喃刺激24 h作用下,He La、Si Ha细胞数量明显减少,细胞核固缩明显,存在凋亡小体,并存在剂量依赖关系。JC-1染色结果表明蔓荆呋喃能够明显降低宫颈癌细胞的线粒体膜电位。4、细胞周期结果表明蔓荆呋喃可以抑制He La细胞在S期和G2/M期,Si Ha细胞在G2/M期。Annexin V/PI双染结果显示在蔓荆呋喃作用下,宫颈癌细胞凋亡率增加明显。5、蛋白质组学分析结果共筛选出482个差异蛋白,KEGG富集分析发现PI3K/AKT以及MAPK信号通路发生显著变化。6、蔓荆呋喃作用24 h后,He La细胞内PI3K、AKT、JNK、ERK和p38蛋白表达无明显变化,而磷酸化的PI3K、AKT、ERK表达下降,磷酸化的JNK表达升高,而磷酸化的p38无明显变化。7、蔓荆呋喃作用24 h后,He La细胞内Apaf-1、cleaved-PARP、cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 8、cleaved-Caspase 9、Bax和Bim蛋白表达水平升高,Bcl-2、Bcl-x L蛋白水平下降。8、DARTS联合质谱技术,结合蛋白质组学分析结果,初步筛选出2个候选蛋白:CCAR1和CYR61。WB分析结果显示CCAR1蛋白表达无明显变化,而CYR61蛋白表达随着药物浓度的增加而升高,提示CCAR1为非功能蛋白。DARTS结果显示,蔓荆呋喃处理组CYR61的蛋白表达水平明显高于对照组。9、CETSA结果显示,蔓荆呋喃处理组CYR61蛋白表达在42℃-62℃范围明显高于对照组。10、MST结果显示,蔓荆呋喃与CYR61之间的解离常数Kd为3.8±4.5μM,显示二者较强的结合能力。11、分子对接结果显示,蔓荆呋喃与CYR61之间有两个结合位点。12、小鼠皮下移植瘤实验结果显示,40 mg/kg蔓荆呋喃连续给药10天,停药观察5天,与对照组相比,小鼠体重无明显变化,有抑制肿瘤生长趋势。结论:蔓荆呋喃能明显抑制宫颈癌细胞增殖和诱导凋亡,作用机制可能为通过与CYR61蛋白结合,促进CYR61表达,进而抑制PI3K/AKT和ERK信号通路,激活JNK信号通路,上调Bim和Bax,下调Bcl-2和Bcl-x L,从而激活线粒体凋亡通路,引起细胞凋亡。