【摘 要】
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目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发生与发展是一个复杂的癌变过程,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染是其主要危险因素之一,探索HBV在肝细胞癌发生发展过程中所起到的作用是人类所面临的重要挑战。本研究通过分析HBV相关HCC患者癌组织及其癌旁组织中HBV S基因突变特征与分布状况,同时本次研究将针对候选突变即s W172*突变,
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目的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发生与发展是一个复杂的癌变过程,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染是其主要危险因素之一,探索HBV在肝细胞癌发生发展过程中所起到的作用是人类所面临的重要挑战。本研究通过分析HBV相关HCC患者癌组织及其癌旁组织中HBV S基因突变特征与分布状况,同时本次研究将针对候选突变即s W172*突变,探索S基因编码截短的乙肝表面抗原小（主）蛋白（smart hepatitis B surface proteins,SHBs）对Hep G2细胞自噬相关基因和凋亡相关基因的影响,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,初步探索该突变对HCC自噬相关基因和凋亡的调控作用。方法1.收集2015～2016年于广西医科大学附属肿瘤医院行手术切除的43例HBV相关HCC患者癌组织及其癌旁组织。使用巢式聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）对HBV S基因片段进行扩增并测序,接下来使用Chromas和DNAMAN软件对S基因序列进行比对分析。2.以编码SHBs的野生型S基因和编码sW172*的突变型S基因为目的片段,使用pc DNA3.1（+）为载体构建真核表达质粒并转染至Hep G2细胞,同时将空质粒pc DNA3.1（+）转染至肝癌Hep G2细胞作为对照组。3.通过反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase reaction,RT-PCR）的方法检测转染后的各组细胞HBV S基因,以判断是否转染成功。4.采用RT-PCR方法检测转染后的各组细胞自噬相关基因（Beclin1、LC3）m RNA以及凋亡相关基因（Caspase-3、Bcl-2）m RNA的相对表达量。5.采用流式细胞术实验检测实验组pcDNA3.1（+）-SHBs、pcDNA3.1（+）-s W172*和对照组pc DNA3.1（+）细胞的凋亡情况。结果1.HCC患者HBV S基因热点突变在癌组织及其癌旁组织中的分布差异无统计学意义（P>0.05）;2.S基因终止突变只存在于癌组织中,突变位点分别为sC69*、s W74*、s L94*、s W172*和s W182*。3.本研究成功构建了表达野生型S基因和突变型S基因（sW172*）的HepG2细胞瞬时转染模型,经RT-PCR验证有野生型和突变型S基因m RNA的表达。4.pcDNA3.1（+）-SHBs和pc DNA3.1（+）-s W172*转染组Beclin1 mRNA表达水平均高于空载质粒pc DNA3.1（+）转染组,差异具有统计学意义（P0.05）;转染pc DNA3.1（+）-SHBs、pc DNA3.1（+）-s W172*和pc DNA3.1（+）的三组细胞之间LC3 m RNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;转染pc DNA3.1（+）-SHBs、pc DNA3.1（+）-s W172*和pc DNA3.1（+）的三组细胞之间Caspase-3 m RNA、Bcl-2 m RNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。5.转染pcDNA3.1（+）、pc DNA3.1（+）-SHBs、pc DNA3.1（+）-s W172*的各组细胞凋亡率分别为4.51±1.15、5.84±3.46和3.92±2.47,三组间差异均无统计学意义（F=0.45,P=0.16）。结论1.广西HBV相关HCC癌组织及其癌旁组织HBV S基因热点突变分布无特异性。2.SHBs终止突变只存在于HCC癌组织中,可能影响HCC的发生发展。3.SHBs和sW172*变异可提高Beclin1m RNA的表达水平,SHBs和s W172*变异可能与肝癌Hep G2细胞自噬有关。4.SHBs和sW172*不是调控HepG2细胞凋亡的主要因素。
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