DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopⅠ)参与机体内的DNA复制、转录和重组反应，是喜树碱类化合物的作用靶标，其结构变化会影响对喜树碱类抑制剂的敏感性。本课题组通过对已知昆虫TopⅠ氨基酸进行比对后，发现昆虫TopⅠ在420，530，653和729四个位点存在多型性，这种多型性是否会影响昆虫对喜树碱类抑制剂的敏感性未见有报道。本研究通过对甜菜夜蛾TopⅠ基因进行定点突变、诱导表达及纯化，研究了氨基酸多型性对TopⅠ解旋活性以及对喜树碱类抑制剂敏感性的影响，并以TopⅠ为靶标进行了非喜树碱类抑制剂的初步筛选。取得如下研究结果:　　完全重叠PCR能实现甜菜夜蛾TopⅠ定点突变，无其他突变引入。在选择的浓度范围内，IPTG均能成功诱导目的蛋白表达，且表达量随着IPTG浓度的增加而增加，但在相同浓度IPTG诱导下，突变蛋白的表达量较野生型明显减少。　　氨基酸多型性对甜菜夜蛾TopⅠ与钾离子的亲和性及解旋活性有影响。相同条件下，与野生型蛋白相比，突变蛋白对钾离子的亲和性均有所增强，启动解旋反应时的钾离子浓度较野生型蛋白低，最适钾离子浓度也有所改变。在最适钾离子浓度下，对DNA的解旋活性也存在差异。其中，L530P突变蛋白的最适钾离子浓度为100mM，较野生型蛋白的最适钾离子浓度(150mM)降低了30％，但两者在最适钾离子浓度下的催化活力一致，比活力均为1.28×109 U/mg pro;A653T突变蛋白对钾离子的适宜浓度范围增宽，在100 mM到200mM范围内的解旋活性均超过80％，但比活力较野生型蛋白降低了50％，为6.40×108 U/mg pro; S729T突变蛋白的最适钾离子浓度与野生型蛋白相同，为150mM，但催化活力较野生蛋白下降了75％，比活力为3.20×108 U/mg pro。　　氨基酸多型性改变了甜菜夜蛾TopⅠ对喜树碱类抑制剂的敏感性。同等条件下，在所选定的浓度范围内，L530P突变蛋白对伊立替康和拓扑替康完全丧失了敏感性，对喜树碱和羟基喜树碱的敏感性临界浓度均为7.5μM，在此临界浓度下，对羟基喜树碱的敏感性与野生型蛋白相当，对喜树碱的敏感度下降了60％。A653T突变蛋白对喜树碱、羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康的敏感性临界浓度分别为5.0μM、7.5μM、7.5μM和10.0μM，在此临界浓度下，对伊立替康的敏感度较野生蛋白提高了28％，对喜树碱、羟基喜树碱和拓扑替康的敏感度则分别下降了40％、70％和80％;S729T突变蛋白对伊立替康和拓扑替康完全不敏感，对喜树碱和羟基喜树碱的敏感性临界浓度分别为0.5μM和2.5μM，在此临界浓度下，对喜树碱和羟基喜树碱的敏感度分别下降了17％和24％。　　氨基酸多型性对甜菜夜蛾TopⅠ与喜树碱和羟基喜树碱的结合速率亦有影响。在敏感性临界浓度下，酶与喜树碱和羟基喜树碱充分结合所用时间存在差异。与野生型蛋白相比，L530P突变蛋白与喜树碱的结合速率下降，酶的解旋活性依然存在，并在4 min时对体系内超螺旋DNA100％解旋，而在野生型蛋白体系内，酶活性被100％抑制;但L530P突变蛋白与羟基喜树碱的结合速率增加，在所测定时间范围内，酶完全失去解旋活性。A653T和S729T突变蛋白与喜树碱的结合速率下降，完全消耗体系内喜树碱所用的时间分别为15 min和8 min，是野生型蛋白(4 min)的3.75倍和2倍;A653T与羟基喜树碱的结合速率增加，充分结合时间为2 min，较野生型蛋白(4min)提前了2 min; S729T与羟基喜树碱充分结合所用时间与野生型蛋白一致，均为4 min，但突变蛋白的羟基喜树碱处理浓度（2.5μM）较野生型蛋白（5.0μM）低，因而，结合速率有所下降。　　通过DNA超螺旋解旋法，测定了羟基喜树碱氯乙基异氰酸酯取代物对突变前后蛋白解旋活性的影响，发现该化合物对野生型蛋白保留了与其母体化合物羟基喜树碱的抑制效果，对L530P和A653T突变蛋白的抑制率较母体化合物有所降低，最大抑制效率分别为20％和16％;对S729T的抑制效果则较母体化合物增加，最大抑制效率为100％。　　利用体外酶活性检测体系，测定了辛可宁，利血平，肉叶云香碱，育亨宾盐酸盐，1-(3，4-二甲氧基苄基)-6，7-二甲氧基异喹啉盐酸盐，3-二甲基氨基甲基吲哚，阿托品，阿马里新，盐酸小檗碱，槲皮素和槐定碱11种化合物对拓扑异构酶解旋活性的影响，结果发现这些化合物对TopⅠ均无抑制活性。　　综上所述，当甜菜夜蛾TopⅠ氨基酸序列中特定位点被替换后，酶的解旋活性和对抑制剂敏感性均发生相应改变。深入开展氨基酸多型性与昆虫TopⅠ对抑制剂敏感性之间的效应关系研究，利用拓扑异构酶体外表达系统，和酶活性检测体系，开发出更多的以TopⅠ为靶标的抑制剂先导化合物，推动新农药创制和应用。