论文部分内容阅读
真菌细胞壁是位于真菌原生质体外的一种刚性结构,对真菌细胞进行正常的生理活动起到重要的保护作用。在真菌细胞生长发育及繁殖的过程中,细胞壁的结构和组分会发生一定的变化,主要表现为细胞壁逐渐地扩张。对酿酒酵母和曲霉的研究成果认为细胞壁扩张的过程是在一系列酶的参与下完成的,β-1,3-葡聚糖酶是其中较为重要的酶类,它通过水解作用使细胞壁松弛,再以转糖基作用将新合成的葡聚糖链加入到原有的细胞壁结构中,使细胞壁得以扩张。为探究在担子菌类食用菌中β-1,3-葡聚糖酶对细胞壁变化所发挥的作用,我们以大型伞状真菌灰盖鬼伞为研究材料,初步分析了其基因组中的p-1,3-葡聚糖酶基因,并筛选了其中较为重要的基因进行重组表达研究,最终获得了2个具有相应活性p-1,3-葡聚糖酶,并对它们的酶学性质进行了研究。以原核表达系统大肠杆菌Rosetta (DE3)为宿主细胞表达出了外切β-1,3-葡聚糖酶(EXG1)。重组菌在200C下经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养48h后可大量表达出目的蛋白,经过超声破碎和Ni-柱层析后可纯化得到EXG1。EXG1分子量大小为85 kDa,酶学性质测定结果表明该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH环境为pH 6.0,只对β-1,3-葡聚糖底物有外切活性,未检测到转糖基活性。以昆布多糖为底物时反应动力学参数Km=2.23 mg ml-1, Vmax=232.56μmol mg-1 min-1。以真核表达系统毕赤酵母GS115为宿主细胞表达出了内切β-1,3(4)-葡聚糖酶(eng16A)。重组菌在30℃下以浓度为0.5%的甲醇进行诱导,可表达出重组酶并分泌到胞外的培养基中,将培养基用Ni-柱纯化后可收获大量的eng16A蛋白。eng16A分子量大小为60 kDa℃对该酶的酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH环境为pH 6.0,对含有β-1,3-糖苷键的底物均能表现出水解活性,未检测到转糖基活性,在以昆布多糖为底物时,反应动力学参数Km=6.49 mg ml-1, Vmax=57.47μmol mg-1 min-1,在以大麦葡聚糖为底物时,反应动力学参数Km=20.84 mg ml-1, Vmax=384.62μmol mg-1min-1。本研究分别以大肠杆菌和毕赤酵母为宿主,对两种p-1,3-葡聚糖酶基因进行了重组表达,获得了具有正确酶活性的目的蛋白,并且用Ni-柱进行分离纯化得到了大量的纯酶。避免了以灰盖鬼伞子实体为原始材料进行层析色谱法纯化过程中子实体生长周期长,纯化步骤繁琐且最终收获的酶量少等一系列问题。同时,我们对这两种p-1,3-葡聚糖酶的酶学性质进行了研究,发现外切β-1,3-葡聚糖酶的生理作用主要表现在对细胞壁中的β-1,3-葡聚糖组分的协同水解,内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的生理作用主要表现在处于营养菌丝阶段时可以水解培养基质中的β-1,3-葡聚糖供给自身的生长发育。这两种β-1,3-葡聚糖酶重组表达的成功,为研究担子菌类真菌细胞壁的组分和结构提供了重要的手段和工具。