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第一章SV40永生化成骨细胞hFOB1.19成骨性、成瘤性验证以及试验体系的建立。
目的：骨肉瘤作为最常见的恶性骨肿瘤，仍缺乏特异性的蛋白分子标志，筛选骨肉瘤特异性蛋白有利于发现新的治疗靶点和开展肿瘤早期诊断。因此，本实验拟采用人骨肉瘤细胞系和SV40永生化的成骨细胞系hFOB1.19作对照，筛选骨肉瘤差异表达蛋白。首先对SV40永生化的hFOB1.19成骨和成瘤性进行验证，建立试验对照体系。
方法：常规培养骨肉瘤细胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和成骨细胞hFOB1.19。待成骨细胞hFOB1.19生长至融合时，采用钙钴法和α-萘基磷酸染色，显示hFOB1.19细胞碱性磷酸酶(ALP)表达，取3张玻片，每张玻片随机计数200个细胞，计算阳性细胞的比率。长期培养的成骨细胞观察其钙化结节的形成，以茜素红染色显示。将成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞IOR/OS9分别接种于5只BALB/c-nu/nu裸鼠的颈部和腹股沟皮下，于SPF环境中饲养8周，观察裸鼠皮下成瘤情况，取皮下瘤测量体积和重量，肿瘤组织行常规切片HE染色。
结果：SV4.0永生化的成骨细胞hFOB1.19呈短梭形、类梭形，多角形，较饱满，胞浆丰富，排列整齐有序，具有典型的成骨细胞形态。ALP的钙钴法染色显示阳性细胞胞浆内呈灰黑色、棕黑色颗粒，α-萘基磷酸法染色阳性细胞呈浅褐色、褐色。阳性细胞多为多角形、细胞体积大，多角形细胞聚集处ALP染色强阳性。计数3张玻片ALP阳性细胞为176±8，阳性率为88.0﹪。hFOB1.19长期培养(20天)细胞呈复层生长，形成矿化结节，钙结节茜素红染色呈橘红色，圆形，边界清晰，计数六孔板之6孔矿化结节数量，hFOB1.19成骨细胞形成钙化结节的数量为110±11。裸鼠成瘤试验显示，5例骨肉瘤细胞IOR/OS9在裸鼠体内全部成瘤，成瘤率100﹪(5/5)，并经HE病理切片证实，而hFOB1.19在裸鼠体内没有成瘤。
结论：SV40永生化的成骨细胞系hFOB1.19具有正常成骨细胞的典型特征，均一性好，增殖快，短期内可获得大量的成骨细胞。hFOB1.19无成瘤性，可以作为骨肉瘤细胞的正常对照，进行比较蛋白质组学研究。
第二章人骨肉瘤细胞株和SV40永生化成骨细胞株hFoB1.19比较蛋白质组学研究。
目的：采用SV40永生化的成骨细胞株hFOB1.19作对照，运用比较蛋白质组学技术，筛选、鉴定3株人骨肉瘤细胞株U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2差异表达的蛋白质，为发现新的治疗靶点和开展早期诊断提供一些路径。
方法：分别提取3株人骨肉瘤细胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化成骨细胞hFOB1.19的细胞总蛋白，经蛋白纯化和定量后，进行2-DE双向凝胶电泳分离蛋白点，经深紫(Deep purple)染色、扫描得到不同样品的蛋白质组图谱，每个样品重复3次独立试验以保证试验的重复性。经ImageMaster V5.0图象分析软件分析，每组肿瘤细胞分别和hFOB1.19比较，以差异比率大于2.0作为有意义的统计学标准(p<0.05，Students t-test)，寻找骨肉瘤差异表达的蛋白质点。
并运用基质辅助的激光电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪，对差异蛋白点进行质谱鉴定，获得各蛋白点的肽质量指纹谱(peptide mass fingerpriming，PMF)，经Mascot在线数据库检索，鉴定骨肉瘤细胞差异表达的蛋白质。
结果：经ImageMaster V5.0图象分析软件分析，差异大于2.0倍的蛋白质点结果为：U2-OS和hFOB1.19相比有32个差异蛋白点，其中U2-OS有10个蛋白点上调，22个蛋白点下调；IOR/OS9和hFOB1.19相比有32个差异蛋白点，其中IOR/OS9有8个蛋白点上调，24个蛋白点下调；SaOS-2和hFOB1.19相比34个差异蛋白点，SaOS-2有上调蛋白点10个，下调蛋白点24个；3组细胞系间共有40个相同的蛋白斑点，3组间共计有58个差异蛋白点。
运用质谱技术，骨肉瘤细胞和正常成骨细胞之间共有26个差异蛋白获得成功鉴定，其中骨肉瘤细胞有9个蛋白上调，17个蛋白下调。热休克蛋白90ATPase的激动剂(activator of 90 kDa shock protein ATPase homolog 1，AHA1)在全部3组骨肉瘤细胞中高表达，AHA1在骨肉瘤细胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2中上调比率分别为23.8倍、24.1倍、12.4倍；Stomatin like protein 2(SLP-2)在2组骨肉瘤细胞中高表达，分别在U2-OS和IOR/OS9中上调7.8倍和10.4倍，SLP-2在SaOS-2中没有明显升高。3组骨肉瘤全部下调的蛋白为谷胱甘肽转移酶omega-1(Glutathione transferase omega-1)、52 kDa Ro protein、乙酰葡糖胺磷酸变位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase)、干扰素诱导GTP结合蛋白Mx1(Interferon-induced GTP-binding protein Mx 1.IFI-78K)。
结论：SV40永生化的成骨细胞hFOB1.19和3株骨肉瘤细胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2蛋白质组存在差异，骨肉瘤细胞差异表达的蛋白质特别是9个上调蛋白，可作为筛选骨肉瘤特异蛋白的候选靶点。
第三章部分差异蛋白的Western blot验证。
目的：鉴于AHA1在3株骨肉瘤细胞、SLP-2在2株骨肉瘤细胞中表达明显升高，选取二者进行Western blot验证。
方法：分别用3株骨肉瘤细胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化的成骨细胞hFOB1.19细胞总蛋白，经10﹪十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，转膜，用AHA1和SLP-2单克隆抗体进行免疫印迹，比较在各组细胞中的表达。试验重复三次以保证可靠性。
结果：与对照组hFOB1.19相比，AHA1在SaOS-2、 IOR/OS9、U2-OS骨肉瘤细胞组表达显著上调。SLP-2在IOR/OS9、U2-OS细胞中表达显著上调，SLP-2在SaOS-2中没有显著性变化。各组的变化趋势与2-DE分析结果基本一致。
结论：Westem blot证实了AHA1和SLP-2在骨肉瘤细胞中的上调表达，蛋白表达趋势和蛋白质组学的结果一致。AHA1和SLP-2在骨肉瘤中的作用，可作为进一步开展靶向治疗的蛋白质候选靶点。