【摘 要】
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目的:有丝分裂是真核细胞进行细胞分裂的主要方式。而纺锤体组装检查点是保证染色体准确分离所必需的。组蛋白甲基转移酶SETDB2被报道参与染色体分离,敲低SETDB2会导致染色体分离异常和有丝分裂延迟,这可能与H3K9me3、着丝粒蛋白CENP-B和CENP-C定位有关[1],但是其在有丝分裂中的具体机制还尚未清楚。因此本课题拟探讨SETDB2在有丝分裂中的功能和具体机制。方法:1、使用siRNA干扰
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目的:有丝分裂是真核细胞进行细胞分裂的主要方式。而纺锤体组装检查点是保证染色体准确分离所必需的。组蛋白甲基转移酶SETDB2被报道参与染色体分离,敲低SETDB2会导致染色体分离异常和有丝分裂延迟,这可能与H3K9me3、着丝粒蛋白CENP-B和CENP-C定位有关[1],但是其在有丝分裂中的具体机制还尚未清楚。因此本课题拟探讨SETDB2在有丝分裂中的功能和具体机制。方法:1、使用siRNA干扰SETDB2表达,并通过免疫荧光和流式细胞术分析SETDB2对有丝分裂的影响;2、在敲低SETDB2的细胞中恢复SETDB2的表达,通过免疫荧光和流式细胞术进一步分析SETDB2对有丝分裂的影响;3、免疫共沉淀检测SETDB2与BUBR1的相互作用;4、免疫共沉淀检测SETDB2对CDC20-BUBR1相互作用以及CDC20-APC3相互作用的影响;5、在敲低SETDB2的细胞中恢复SETDB2野生型和甲基转移酶活性缺陷突变体,利用免疫荧光和免疫共沉淀分析SETDB2在有丝分裂中的调控是否依赖于其甲基转移酶活性;6、免疫共沉淀检测SETDB2与微管蛋白α-TUBULIN和β-TUBULIN之间的相互作用;7、免疫荧光观察SETDB2与微管蛋白α-TUBULIN、β-TUBULIN在有丝分裂间期和有丝分裂各时期的细胞亚定位情况。结果:1、敲低SETDB2导致出现异常核细胞比例增加,影响了有丝分裂中期染色体排列和后期染色体分离,流式结果显示敲低SETDB2导致细胞阻滞在G2/M期;2、恢复SETDB2表达能够挽救敲低SETDB2所导致的有丝分裂缺陷和细胞周期阻滞;3、SETDB2与BUBR1相互作用;4、敲低SETDB2削弱了 CDC20与BUBR1之间的相互作用,进而影响了 CDC20和APC3之间的相互作用;5、恢复SETDB2野生型和甲基转移酶活性缺陷突变体均能挽救由于敲低SETDB2所致的有丝分裂缺陷,且SETDB2与BUBR1之间的相互作用不依赖于SETDB2的甲基转移酶活性;6、免疫沉淀结果显示SETDB2与微管蛋白α-TUBULIN和β-TUBULIN存在相互作用;7、免疫荧光发现SETDB2与TUBULIN主要在有丝分裂中期和后期共定位,而在有丝分裂间期、前期和末期很少共定位。结论:微管结合蛋白SETDB2通过和BUBR1相互作用促进CDC20-APC3相互作用从而保证染色体准确分离,且这种调控并不依赖于SETDB2的甲基转移酶活性。
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