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研究背景脓毒症是临床常见病,在重症监护室（Intensive care unit,ICU）尤为多见。其发病率较高,病情凶险,常引发多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome,MODS）甚至死亡,是临床治疗的重点和难点。尽管ICU专业设备和支持治疗有了长足发展,但脓毒症患者的异质性加大了治疗难度,其死亡率仍居高不下。此外,脓毒症给患者和医疗卫生系统都造成沉重负担。仅在美国,每年用于脓毒症诊疗的费用超过167亿美元。虽然其发病机制尚未完全阐明,但大量研究表明巨噬细胞可以通过启动炎症级联反应,在脓毒症的发生发展中扮演着举足轻重的角色。当外源病原体或者其他有害理化刺激入侵机体时,巨噬细胞被激活,向促炎型（M1型）极化,分泌多种炎性细胞因子,引发炎性因子级联瀑式效应,同时产生大量氧化自由基,加重组织损伤。因此,抑制巨噬细胞向M1型极化和降低炎症因子水平是治疗脓毒症的策略之一。脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）外泌体作为一种重要的细胞间通讯物质在组织损伤、修复和再生中发挥重要作用。大量研究表明ADSCs外泌体在脓毒症、急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）等多种疾病中通过减轻炎症发挥保护作用。ADSCs外泌体可通过调控MAPK和Notch信号通路抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB）进而干预巨噬细胞向M1型极化,但具体机制仍有待探讨。近年来,大量研究表明Nrf2/HO-1信号通路在巨噬细胞极化和炎症反应中具有重要作用,高表达的HO-1可以促进巨噬细胞向M2型极化。而ADSCs外泌体能否通过Nrf2/HO-1轴调控巨噬细胞炎症反应尚无报道。研究目的观察人ADSCs外泌体对巨噬细胞极化的调控作用,研究揭示血红素加氧酶1（Hemeoxygenase-1,HO-1）参与ADSCs外泌体对巨噬细胞极化及发挥抗炎作用的具体机制,探索脓毒症组织损伤保护的新途径。旨在为ADSCs外泌体的临床应用提供理论依据,为脓毒症的治疗提供新的策略。研究方法1.收集脂肪标本,通过胶原酶消化法分离获得原代ADSCs,选取3～5代ADSCs进行流式细胞术鉴定。对ADSCs扩增培养,收集细胞培养上清,通过超高速差速离心法提取其外泌体。通过透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒子数及粒径大小,蛋白电泳（Western blot）对其表面标记物进行鉴定,并通过PKH26对ADSCs外泌体进行标记,与巨噬细胞共培养,激光共聚焦观察巨噬细胞对外泌体的内吞作用。2.脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激三种不同巨噬细胞构建体外脓毒症炎症反应模型,聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）检测炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）等的表达。分别使用外泌体和LPS刺激巨噬细胞,检测不同处理组巨噬细胞炎性因子表达、M1/M2型巨噬细胞特异性标记物表达,流式细胞术和免疫荧光分别检测巨噬细胞表面标记物和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）荧光强度,分析ADSCs外泌体对巨噬细胞的炎症调控作用。3.通过对ADSCs外泌体处理后巨噬细胞行PCR和Western blot检测HO-1表达,确定ADSCs外泌体对巨噬细胞HO-1的调控作用。随后使用HO-1特异性小干扰RNA（Small interference RNA,si RNA）对巨噬细胞进行转染,抑制HO-1表达,进一步检测HO-1表达受抑制时ADSCs外泌体对巨噬细胞炎症反应的抑制效果。并通过检测HO-1上游调控因子核因子E2相关因子2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like epichlorohydrinassociated protein 1,Keap1）确定ADSCs外泌体对HO-1的调控机制。4.通过对BALB/C小鼠行盲肠结扎穿孔术（Cecal ligation and puncture,CLP）构建在体小鼠脓毒症模型,尾静脉注射ADSCs外泌体观察小鼠48小时内死亡率,收集脓毒症小鼠血清行酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked-immunosorbent serologic assay,ELISA）检测TNF-α和IL-1β水平,收取心、肝、肺、肾等组织行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察器官损伤程度,提取肺组织蛋白和RNA检测HO-1表达,对肺和肝组织分别行HO-1免疫组化染色和巨噬细胞特异性标记物免疫荧光染色,观察ADSCs外泌体对脓毒症小鼠脏器的保护作用。研究结果1.成功分离获得了原代ADSCs,流式细胞术鉴定,CD29、CD44、CD73和CD90呈阳性,而CD34和CD45呈阴性,符合ADSCs特性。对获得的原代ADSCs传代扩增后,超高速离心法从培养上清中成功提取了ADSCs外泌体,通过NTA、Western blot和透射电镜鉴定,其形态、大小和特异性标记物符合外泌体特征,且提取的外泌体可被巨噬细胞摄取。2.通过LPS刺激巨噬细胞成功建立体外脓毒症炎症反应模型,通过PCR检测发现LPS刺激12小时能有效模拟体外炎症反应。ADSCs外泌体处理可以减轻LPS诱导的巨噬细胞炎性因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）风暴,降低M1型巨噬细胞特异性标记物i NOS和CD86表达,增加M2型巨噬细胞特异性标记物Arg-1和CD206表达,促进巨噬细胞向M2型极化,同时减轻ROS积累。3.Western blot和PCR结果证实ADSCs外泌体可以增加巨噬细胞HO-1表达。通过HO-1抑制实验证实,当HO-1表达受抑制时,ADSCs外泌体对炎性因子和M1型特异性标记物的抑制效果明显减弱,表明ADSCs外泌体的抗炎效果依赖HO-1表达。Western blot和PCR进一步检测HO-1上游调控分子发现:ADSCs外泌体可以通过降低Keap1表达、增加Nrf2的表达及核转位,从而调控HO-1。4.在体脓毒症模型中,ADSCs外泌体提高肝和肺组织中HO-1的表达,同时降低M1型巨噬细胞比例,将巨噬细胞极化为M2表型,减轻血清中炎症因子IL-1β和TNF-α表达,改善CLP诱导的脓毒症小鼠器官损伤,有效降低脓毒症小鼠死亡率。研究结论ADSCs外泌体可以通过抑制巨噬细胞Keap1,促进Nrf2的表达和核转位,上调细胞保护性蛋白HO-1表达,进而发挥抗炎抗氧化的作用。在脓毒症损伤模型中,ADSCs外泌体通过上调HO-1表达减轻CLP诱导的炎症反应,使巨噬细胞向M2型极化,改善受损器官的功能,最终降低脓毒症小鼠死亡率。本研究为ADSCs外泌体减轻炎症反应提供了理论依据,为临床脓毒症治疗提供了新策略。