宫颈癌严重危害女性健康,全球每年发病率近13例/10万,其中每10万人约有7人因宫颈癌死亡。宫颈癌具有高复发性和高致死性的特点,目前宫颈癌治疗的常规手段为手术联合放化疗,放疗是局部晚期宫颈癌和复发性宫颈癌不可替代的治疗措施。但是,宫颈癌细胞的辐射抗性是影响放疗疗效的重要原因。研究报道,根治性放疗后宫颈癌患者的淋巴结复发率高达10-20%,晚期宫颈癌和局灶复发性宫颈癌患者的五年生存率不到10%。去泛素化酶的异常表达影响肿瘤的发生发展、细胞侵袭转移和放化疗抵抗等多个方面,当前靶向泛素-蛋白酶体的抑制剂已经应用于临床肿瘤治疗中,如硼替佐米已经批准应用于多发性骨髓瘤的治疗。以去泛素化酶为靶点正逐渐成为研究肿瘤临床放疗增敏剂的新兴领域。羧基末端水解酶L5（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases L5,UCHL5）是去泛素化酶羧基末端水解酶家族的成员之一,蛋白酶体19S调节亚基的h Rpn13作为受体将UHCL5募集至蛋白酶体上,识别并去除蛋白底物上的多聚泛素链,随后被解构展开的蛋白转运进入20S核心颗粒亚基被降解。UCHL5具有细胞周期调控、抗凋亡、维持基因完整性和DNA损伤修复等功能,广泛表达于真核细胞的胞浆和胞核中,参与多种转录因子的调控。目前,尚无证据表明UCHL5具有调节宫颈癌辐射敏感性的作用;本研究旨在明确UCHL5在宫颈癌辐射敏感性中的调节作用,筛选UCHL5的作用靶分子,初步探讨UCHL5及其靶分子调控宫颈癌细胞的辐射敏感性的作用和机制。研究目的:1.明确UCHL5调节宫颈癌细胞辐射敏感性的作用;2.探究UCHL5影响宫颈癌细胞辐射敏感性的机制。研究方法:1.采用免疫组织化学染色方法观察64例临床宫颈癌组织和邻近的癌旁组织中UCHL5的表达差异;使用GEPIA在线数据库对来源于TCGA和GTEx数据库的306例宫颈癌组织和13例正常组织中UCHL5的表达差异和宫颈癌患者的预后进行分析。2.单次剂量γ射线照射宫颈癌Hela和Siha细胞,观察宫颈癌细胞UCHL5表达水平的变化;采用2Gyγ射线连续多代照射宫颈癌Hela和Siha细胞,观察宫颈癌细胞UHCL5表达水平的变化。3.构建过表达和沉默UCHL5的慢病毒载体并感染Hela和Siha细胞,建立UCHL5稳定过表达或低表达的细胞系,实时荧光定量PCR和Western blot验证Hela和Siha细胞中调变UHCL5表达的效率。4.采用细胞克隆形成实验,观察分别在0、2、4、6、8、10Gyγ射线照射调变UCHL5的Hela和Siha细胞后,细胞的克隆形成率和细胞存活分数的差异,使用单击多靶模型拟合生存曲线,观察调变UCHL5对宫颈癌Hela和Siha细胞辐射敏感性的影响。5.MTT实验观察调变UCHL5表达水平对宫颈癌Hela和Siha细胞的增殖活性的影响,以及调变UCHL5表达联合辐照对细胞增殖活性的影响。6.裸鼠荷瘤实验观察UHCL5表达水平的改变对Hela细胞移植瘤形成能力的影响。7.流式细胞术检测调变UCHL5表达水平对Hela细胞自发凋亡及辐射诱导凋亡的影响,观察不同UHCL5表达水平以及联合8Gyγ射线照射24h后对Hela细胞周期的影响;划痕实验观察调变UCHL5表达水平对Hela细胞迁移能力的影响。8.转录组测序技术筛选沉默UCHL5组相比于对照组Hela细胞中显著差异表达基因,串联亲和纯化结合质谱技术检测UCHL5直接结合的蛋白分子,联合两组数据筛选UCHL5的靶标分子;使用GEPIA分析UCHL5和XRCC6在宫颈癌组织中的表达相关性。9.Western blot观察调变UCHL5表达对Hela和Siha细胞中XRCC6表达的影响,使用免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co IP）和免疫荧光共定位技术观察UCHL5和XRCC6的相互作用以及调变UCHL5的Hela细胞中XRCC6的泛素化水平;使用新蛋白合成抑制剂环乙酰亚胺（CHX）处理沉默UCHL5表达的Hela和Siha后,观察UCHL5对XRCC6蛋白半衰期的影响。10.构建特异性的XRCC6 sh RNA的慢病毒载体,感染Hela和Siha细胞构建稳定沉默XRCC6表达的细胞株,借助MTT实验观察调变XRCC6表达对Hela和Siha细胞增殖活性的影响。11.MTT实验和克隆形成实验观察抑制过表达UCHL5的Hela和Siha细胞中XRCC6的表达后联合8Gyγ射线照射,对受照细胞增殖活性和克隆形成能力的影响。12.使用基因本体论（GO）富集分析、KEGG通路富集分析和基因集富集分析（GSEA）对转录组测序和串联亲和纯化得到的显著差异基因进行功能富集分析。13.使用免疫沉淀（IP）观察UHCL5和β-catenin在Hela细胞中的相互作用以及UCHL5表达水平改变对β-catenin泛素化水平的影响;14.Western blot观察调变UCHL5表达水平对宫颈癌Hela和Siha细胞中Wnt/β-catenin信号通路及其下游效应分子的影响。研究结果:1.相比于癌旁组织,宫颈癌组织中UCHL5明显高表达,GEPIA分析UCHL5在宫颈癌组织中也显著高表达,并且高表达UCHL5的宫颈癌患者的总体生存期和无病生存期均缩短;2.单剂量照射和连续多代照射均可诱导宫颈癌Hela和Siha细胞中UCHL5的表达。3.成功建立稳定调变UCHL5表达的Hela和Siha细胞系;4.过表达UCHL5促进了宫颈癌Hela和Siha细胞的辐射抗性,相反,沉默UCHL5的表达减弱了细胞的辐射抗性。5.UCHL5促进Hela和Siha细胞的增殖,联合0-10Gy的γ射线照射后,UCHL5增强了受照细胞的增殖活性;6.体内实验结果显示,过表达UCHL5增强了Hela细胞的移植瘤形成的能力。7.过表达UCHL5抑制了Hela细胞的自发凋亡和辐照诱导的细胞凋亡,相反,沉默UCHL5后Hela细胞的自发凋亡率明显增加,并且促进了辐射诱导的细胞凋亡。过表达UHCL5促进了宫颈癌Hela细胞的周期进展;联合γ射线照射后细胞出现了G2/M期阻滞,过表达UHCL5可以缓解G2/M期阻滞;相反沉默UCHL5表达细胞周期G1期明显增加,加重了辐照诱导的G2/M期阻滞;此外,过表达UCHL5促进Hela细胞的迁移。8.转录组测序和串联亲和纯化结果显示,XRCC6在沉默UCHL5组的表达明显降低,且在宫颈癌组织中UCHL5和XRCC6的表达水平呈正相关,预测XRCC6可能是UCHL5的靶分子。9.宫颈癌Hela和Siha细胞中UCHL5和XRCC6相互作用,同时过表达UCHL5的细胞中XRCC6结合的泛素分子减少,相反沉默UCHL5表达的细胞中XRCC6结合的泛素分子增多;环乙酰亚胺处理后,沉默UCHL5的Hela和Siha细胞中XRCC6蛋白的半衰期明显缩短。10.抑制XRCC6的表达降低了Hela和Siha细胞的增殖活性;但是将过表达UHCL5的Hela和Siha细胞中的XRCC6抑制后,对于UCHL5增强受照细胞增殖活性作用无明显影响。克隆形成实验结果显示,分别在0Gy和8Gy照射条件下,抑制过表达UHCL5的Hela和Siha细胞中XRCC6的表达后,细胞的克隆形成能力减弱。11.与癌旁组织相比,宫颈癌组织中XRCC6表达水平明显升高,且XRCC6和UCHL5表达水平有较弱的正相关性。12.差异表达基因显著富集在Wnt/β-catenin信号通路、细胞周期调控和细胞迁移等信号通路中。13.UCHL5和β-catenin在宫颈癌Hela细胞中相互作用,并且过表达UCHL5降低了β-catenin的泛素化水平,而沉默UCHL5的Hela细胞中β-catenin的泛素化水平增加。14.过表达UCHL5促进了宫颈癌Hela和Siha细胞中β-catenin、CD44、c-Myc、c-Jun和TCF1/TCF7的蛋白表达。结论:1.UCHL5在宫颈癌组织中高表达并且高表达UCHL5的宫颈癌患者预后更差;体外实验表明,辐照可诱导宫颈癌细胞中UCHL5的表达;UCHL5降低了宫颈癌细胞的辐射敏感性。2.裸鼠荷瘤实验结果显示,过表达UHCL5增强了宫颈癌Hela细胞移植瘤形成能力。3.UCHL5和XRCC6在宫颈癌Hela和Siha细胞中相互作用,通过去泛素化酶活性维持XRCC6蛋白的稳定性,增强宫颈癌细胞的存活能力。4.UCHL5通过去泛素化酶活性稳定β-catenin的表达,促进宫颈癌Hela和Siha细胞中CD44、c-Myc、c-Jun和TCF1/TCF7的表达。