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丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)作为一种食品加工副产物广泛存在于各类食品中,是确认的人类周围神经毒物,但ACR对学习记忆的影响及机制研究报道极少。本研究以体内体外实验相结合,研究ACR亚慢性经口染毒对大鼠学习记忆的影响及分子机制和信号通路机制,为深化ACR神经毒性及机制,为防控ACR毒性分子靶点奠定基础。第一部分丙烯酰胺对大鼠学习记忆能力的影响目的:以神经行为学和病理学改变为观察指标,采用经口灌胃染毒方式,建立亚慢性ACR染毒模型,探讨ACR对大鼠学习记忆能力的影响。方法:SPF级健康成年雄性SD大鼠36只,体重140 g~160 g,随机分为3组,对照组(12只)、ACR1组(5 mg/kg ACR,12只)、ACR2组(10 mg/kg ACR,12只),连续灌胃染毒14周;每周称量大鼠体重、评估大鼠步态评分,第13周时进行Morris水迷宫试验(MWM),第14周时测量大鼠后肢抓力以及后肢撑力指数。14周染毒结束后,处死所有动物,称量主要脏器并计算脏器系数。HE染色观察海马神经元结构,免疫组织化学观察NeuN~+细胞数,免疫荧光观察神经元胶质化,透射电镜观察海马CA1区超微结构。结果:(1)整体毒性:染毒期间各组大鼠一般情况良好,无异常大鼠死亡。染毒期间各组大鼠体重无明显差异(P>0.05),各组大鼠脏各器系数无明显差异(P>0.05)。(2)步态和肌张力改变:ACR1组大鼠在染毒第10~13周出现轻微步态异常(P<0.05),后肢抓力和撑力指数无明显变化(P>0.05);ACR2组在染毒第6~13周出现轻度到中度步态异常(P<0.05),后肢抓力明显降低(P<0.01),后肢撑力指数明显增加(P<0.01)。(3)学习记忆能力变化:(1)定位航行试验中,三组大鼠的游泳速度无明显差异(P>0.05);ACR1组大鼠逃避潜伏期无明显改变(P>0.05);ACR2组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01)。(2)空间探索试验中,ACR1组和ACR2组大鼠在目标象限的游泳距离和时间均明显减少(P<0.05)。(4)一般病理学变化:(1)HE染色:ACR1和ACR2组海马区神经元数量减少,部分神经元细胞膜、核膜界限不明显,有少量坏死神经元。(2)NeuN免疫组化:ACR1组海马CA1和DG区NeuN~+细胞明显减少(P<0.05),ACR2组海马CA1、CA3和DG区NeuN~+细胞数量也明显减少(P<0.01)。(3)神经元胶质细胞增生:ACR1组CA1区星形胶质细胞明显增生(P<0.05),CA3区星形胶质细胞和小胶质细胞均明显增生(both P<0.05);ACR2组CA1和CA3区星形胶质细胞和小胶质细胞均明显增生(all P<0.001)。(5)超微病理学改变:(1)突触结构的改变:ACR1组和ACR2组突触结构不完整,突触间隙变模糊,突触后膜密度下降。(2)髓鞘结构改变:ACR1组髓鞘的板层结构分离,ACR2组髓鞘板层结构明显分离伴少量脱髓鞘。(3)神经丝的改变:ACR1组神经丝分布较密集,ACR2组神经丝大量聚集。结论:ACR在5、10 mg/kg剂量下染毒14周可导致大鼠学习记忆能力受损;海马神经元的丢失、胶质细胞的增生、突触结构的破坏是ACR导致大鼠学习记忆能力损伤的病理学基础。第二部分丙烯酰胺导致大鼠学习记忆损伤的机制目的:围绕与学习记忆密切相关的tau蛋白、CREB-BDNF及其下游的突触囊泡蛋白(Synaptic vesicle protein,SVP)突触素-1(Synapsin-1,SY-1)和突触小泡蛋白(Synaptophysin,SYN),以及PERK-e IF2α和ALP信号通路,研究ACR导致大鼠学习记忆损伤的潜在机制。方法:动物分组与处理同上,免疫组织化学检测海马区AT8(p S202/p T205)的表达与分布,Western blot检测海马组织中tau蛋白及其激酶、SY-1、SYN、PERK-e IF2α和ALP信号通路中各相关蛋白的表达量。结果:(1)磷酸化tau蛋白的变化:(1)AT8的表达与分布:ACR1组和ACR2组海马CA1、CA3和DG区可见棕黄色AT8免疫阳性细胞分布,阳性细胞计数显著增加(all P<0.001)。(2)tau蛋白的表达量变化:ACR1组AT8、p S262的蛋白表达显著增加(both P<0.01),ACR2组AT8、p S396、p S262的表达量均显著高于对照组和ACR1组(all P<0.05)。(3)蛋白激酶GSK-3β和Cdk5的变化:ACR1组和ACR2组抑制性P-GSK-3β(Ser9)的表达量均明显降低(P<0.01),p25/p35的表达量均明显增加(P<0.01)。(4)蛋白磷酸酶PP2A的变化:ACR1和ACR2组抑制性p-PP2Ac Tyr307的表达量显著增加(both P<0.05)。(2)SVP表达水平的变化:(1)SY-1、SYN的蛋白表达变化:ACR1组SY-1蛋白表达量无显著变化(P>0.05),SYN蛋白的表达显著降低(P<0.05),ACR2组SY-1、SYN的蛋白表达明显低于对照组和ACR1组(all P<0.01)。(2)CREBBDNF的表达量变化:ACR1、ACR2组P-CREB和BDNF的蛋白表达与对照组相比显著降低(all P<0.05)。(3)PERK-e IF2α信号通路:ACR1和ACR2组海马GRP78、P-PERK、Pe IF2α、ATF4、CHOP的表达量与对照组相比均明显增加(all P<0.05);且与ACR1组相比,ACR2组GRP78、P-e IF2α、ATF4的表达量均明显增加(all P<0.05)。(4)ALP信号通路:ACR1组中p62的表达量明显增加(P<0.05),成熟型Cathepsin-D的表达量明显降低(P<0.05);ACR2组LC3-II/I显著增加(P<0.01)、p62的表达量显著升高(P<0.001),成熟型Cathepsin-D的表达量显著降低(P<0.001)。结论:海马tau蛋白磷酸化水平增加、CREB-BDNF及其下游SY-1和SYN表达降低是ACR导致学习记忆损伤的分子机制。PERK-e IF2α和ALP信号通路可参与调控ACR导致学习记忆的损伤。第三部分PERK和ALP在丙烯酰胺损伤学习记忆中的作用目的:在细胞水平,采用特异性抑制剂和激动剂进行干预实验,研究PERKe IF2α和ALP信号通路在ACR导致学习记忆损伤中的调控作用,为防控ACR神经毒性提供新的分子靶点。方法:细胞染毒处理:0~10 mmol/L ACR处理SH-SY5Y细胞24 h;CCK8法测细胞的存活率;相差显微镜观察细胞形态。激动剂或抑制剂处理:ALP激动剂(200 nmol/L Rapa)或PERK抑制剂(0.5μmol/L GSK2606414)分别预处理细胞2 h后,再以2.5 mmol/L ACR染毒24 h;Western blot测定ALP和PERK-e IF2α信号通路关键蛋白表达量以及磷酸化tau蛋白和SVP的表达水平;免疫荧光观察细胞内磷酸化tau蛋白的表达与分布;LC3免疫荧光标记自噬体,吖啶橙标记自噬溶酶体,溶酶体探针(Lyso Tracker Red)标记细胞内溶酶体,激光共聚焦技术观察细胞内自噬体、自噬溶酶体和溶酶体的数量,检测自噬流。结果:(1)细胞存活率:2.5、5 mmol/L ACR染毒24 h后,细胞数目减少,贴壁能力减弱,神经突收缩,少部分细胞呈球状漂浮,细胞存活率明显降低(P<0.001),且具有剂量-效应关系。(2)磷酸化tau蛋白和SVP的变化:(1)磷酸化tau蛋白:2.5、5 mmol/L ACR组p S396、p S262和AT8的蛋白表达显著增加(all P<0.001),抑制性P-GSK-3βSer9的表达显著降低(P<0.05);(2)SVP的改变:2.5、5 mmol/L ACR组SY-1、SYN、P-CREB和BDNF的表达量显著减少(all P<0.05)。(3)PERK-e IF2α和ALP信号通路:(1)PERK-e IF2α信号通路的变化:2.5、5 mmol/L ACR组GRP78、P-PERK、P-e IF2α、ATF4和CHOP的表达量显著增加(P<0.05),且具有剂量-效应关系。(2)ALP的变化:2.5、5 mmol/L ACR组LC3-II/I和p62的表达量显著增加(both P<0.05),成熟型Cathepsins-D的表达量显著降低(P<0.05)。(4)PERK-e IF2α干预试验:与ACR组相比,PERK抑制剂GSK2606414预处理2 h后,(1)可显著降低P-PERK的表达水平(P<0.05),且其下游靶蛋白Pe IF2α、ATF4和CHOP的表达量也明显降低(all P<0.05);(2)可显著降低p S396、p S262和AT8的表达量(all P<0.05);(3)可显著增加P-CREB和BDNF的表达水平(both P<0.05);(4)突触囊泡蛋白SYN和SY-1的表达量无明显变化(P>0.05)。(5)ALP干预试验:与ACR组相比,Rapa预处理2 h后,(1)显著降低p62表达量(P<0.01),增加成熟型Cathepsins-D的表达水平(P<0.01),自噬溶酶体和溶酶体的聚集增加;(2)显著降低p S396、p S262和AT8的表达量(all P<0.01);(3)明显增加BDNF的表达量(P<0.05);(4)突触囊泡蛋白SYN和SY-1的表达量无明显变化(P>0.05)。结论:PERK-e IF2α的激活和ALP的抑制介导了ACR导致的磷酸化tau蛋白的增加以及BDNF的降低,但未参与ACR介导突触囊泡蛋白SYN和SY-1表达降低的调节。