本课题的目的在于分离、培养胚胎肝细胞，胚胎肝细胞作为肝干细胞鉴定其干细胞的特征。分离及移植胚胎肝细胞给同基因小鼠，持续应用诱癌剂，探讨胚胎肝干细胞增殖、分化为肝细胞和胆管细胞的能力和治疗肝损害和肝纤维化的作用。并探讨在诱癌环境下肝干细胞癌变的潜能，为肝癌是否来源于肝干细胞提供直接的证据，以及为肝干细胞应用的安全性提供理论和实验依据。 第一部分胚胎肝干细胞的分离、培养与鉴定。 目的：胚胎肝脏中分离、培养肝干细胞，并进行鉴定。 方法：取孕14d的小鼠胚胎肝脏标本，采用胶原酶消化法，分离小鼠胚胎肝细胞。用细胞计数板计数、胎盼蓝染色测定细胞活性百分率，调整细胞密度(2×10<6>/ml)进行原代培养(37℃，5﹪CO<,2>)。通过光镜、电镜对胚胎肝细胞进行形态学观察，通过免疫细胞化学ABC法及免疫荧光检测胚胎肝细胞AFP，ALB，CK19，GST-P的表达情况，鉴定其肝干细胞的特征。 结果：胶原酶可有效消化胚胎肝脏结缔组织，使肝脏细胞易于分离，得到胚胎肝细胞。原代培养贴壁时间为2～3天，培养中可见小梭形或多角形细胞及成熟肝细胞贴壁生长，随后可见成熟肝细胞逐渐破碎、消失，而梭形或多角形细胞经过分裂增殖、迁移和相互作用，形成干细胞集落的融合，呈圆形或形状不规则的上皮样细胞形态，长满后传代，第一次传代时间6～7d。光镜下观察孕14d的小鼠胚肝细胞在胚胎肝脏内弥散分布，数量少，体积小，形态不规则，核圆形或卵圆形，核质比例大，核深染，胞质颜色较淡，显示出幼稚细胞的形态学特征。免疫组化显示这些细胞表达AFP、ALB、CK19、GST-P。随孕期延长，肝细胞逐渐增加，体积增大，细胞核大、淡染，表明胚胎肝细胞逐渐分化成熟。电镜下观察胚胎肝细胞直径约7-14um，表面可见少量短小的微绒毛状突起，整个细胞大部分被卵圆形细胞核所占据，细胞质少，核浆比例大，内质网、线粒体、核糖体等细胞器不发达，表现为原始幼稚未分化细胞的特点。免疫组化或免疫荧光染色结果显示培养的胚胎肝细胞表达AFP、ALB、CK19、GST-P，提示胚胎肝细胞具有肝干细胞的特征。 结论：孕14d的小鼠胚胎肝细胞具有肝干细胞的特征，在体外能培养及传代生长。为胚胎肝干细胞的存在提供了实验依据。 第二部分胚胎肝干细胞移植治疗慢性肝损伤的研究。 目的：探讨胚胎肝干细胞增殖分化为肝细胞和胆管细胞的能力，及胚胎肝干细胞移植减轻慢性肝损害和肝纤维化的作用。 方法：分离孕14d的胚胎肝脏的肝干细胞。分离的胚胎肝干细胞被认为由50﹪的雄性细胞和50﹪的雌性细胞组成。小鼠行部分肝切除后，新鲜分离的胚胎肝干细胞用胰岛素注射器经肠系膜静脉注射到同基因型的雌性小鼠肝脏。然后，DEN加入饮用水中，浓度为100 μ g/L，连续饮用12周诱导慢性肝损伤。60只雌性小鼠随机分为3组(n=20)：对照组，胚胎肝细胞移植及饮正常水；模型组，饮水中加DEN诱导慢性肝损伤；治疗组，胚胎肝细胞移植及饮含DEN的水。细胞移植后1，2，3个月分别杀死小鼠取肝脏标本。细胞移植3月后取血检测肝功能指标和肝纤维化指标。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素用常规实验室方法测定，血清透明质酸酶(HA)和层粘连蛋白(LN)用放免试剂盒测定。取肝脏标本测定羟基脯氨酸(Hyp)含量及病理学检查。HE染色和α-SMA免疫组化染色确定肝脏炎症及肝纤维化程度。用免疫组化显示SRY的表达来确定移植胚胎肝干细胞在肝内的增殖和分化。 结果：胚胎肝干细胞治疗组DEN诱导小鼠的生存率为90﹪，模型组DEN诱导小鼠的生存率为80﹪，两组间无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组相比，模型组DEN导致血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶显著升高(P<0.01)。胚胎肝干细胞治疗组转氨酶水平明显降低(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。各组血清胆红素无显著性差异(P>0.05)。胚胎肝干细胞治疗组血清HA、LN水平明显低于模型组(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。细胞移植实验组肝脏Hyp含量明显低于模型组(P<0.01)，但高于正常对照组(P<0.01)。HE染色和α-SMA免疫组化染色显示胚胎肝干细胞移植能明显减轻DEN诱导的脏炎症和肝纤维化。模型组活化的肝星状细胞表达α-SMA增加，呈网状结构。而胚胎肝干细胞治疗组的肝星状细胞增殖明显受抑制。在DEN诱导小鼠，细胞移植后SRY阳性细胞分布在门静脉周围，细胞移植后1个月肝脏内发现散在SRY阳性细胞。2个月后肝脏内SRY阳性细胞明显增多，存在于肝实质内。3个月后肝脏内存在大量的SRY阳性细胞。我们还发现成熟的SRY阳性的胆管细胞形成。细胞移植后1个月肝脏内出现SRY阳性胆管细胞，3个月后SRY阳性胆管细胞明显增多。移植细胞的增殖随时间延长而持续增加，1，2，3月后移植细胞的增殖占分别占肝脏的5-10﹪，15-20﹪及30-50﹪。缺乏DEN诱导的小鼠，胚胎肝干细胞移植3个月后发现肝内有散在的SRY阳性细胞。 结论：在DEN诱导慢性肝损伤过程中，移植的胚胎肝干细胞在肝脏内有向肝细胞和胆管细胞高增殖分化的能力。增殖的胚胎肝细胞通过替代受损的肝细胞来有效地恢复肝损害和减轻肝纤维化。本研究提示胚胎肝干细胞移植是一种有效治疗慢性肝脏疾病的方法。 第三部分胚胎肝干细胞癌变潜能的研究。 目的：肝癌的细胞起源目前仍有争议。有证据显示肝干细胞可能是肝癌癌变的靶细胞，是干细胞分化受阻的结果。但目前尚无肝干细胞癌变的直接证据。本研究探讨在诱癌环境下移植肝干细胞在肝脏内癌变的潜能。 方法：分离孕14天的胚胎肝干细胞。分离的胚胎肝干细胞被认为由50﹪的雄性细胞和50﹪的雌性细胞组成。小鼠行部分肝切除后，新鲜分离的胚胎肝干细胞用胰岛素注射器经肠系膜静脉注射到同基因型的雌性小鼠肝脏。然后，DEN加入饮用水中，浓度为100μg/L，连续饮用12周，再饮用正常水12周诱导肝癌。70只雌性小鼠随机分为3组：对照组(n=10)，胚胎肝干细胞移植及饮正常水；模型组(n=30)，饮水中加DEN诱导肝癌；实验组(n=30)，胚胎肝干细胞移植及饮含DEN的水。6个月后杀死小鼠取肝脏标本。取肝癌结节做连续切片用免疫组化或免疫荧光染色的方法分析SRY、AFP、GST-P或CK19的表达，以研究肝癌的细胞来源和特征。SRY的表达显示肝癌的细胞来源，GST-P、AFP或CKl9的表达显示肝癌的细胞特征。 结果：DEN诱癌的小鼠在6个月实验结束后有17只存活，成活率为32.7﹪(17/52)。成活的17只小鼠有15只检出肝癌，诱癌率为88.2﹪(15/17)。其中模型组和实验组成功诱癌分别有7只和8只，诱癌率分别为87.5﹪(7/8)、88.9﹪(8/9)；两组间的诱癌率无显著性差异(P>0.05)。肿瘤在肝脏形成多发灶，肝癌结节多为5～10个，直径3～10mm。13只小鼠的肝脏肿瘤为肝细胞性肝癌，占86.7﹪；其中模型组和实验组分别占6只和7只。2只小鼠的肝脏肿瘤为胆管细胞性肝癌，占13.3﹪；模型组和实验组各占1只。两组间的肿瘤病理类型无显著性差异(P>0.05)。17.1﹪的肝细胞癌结节内的癌细胞SRY染色是阳性的，胆管细胞癌结节内的癌细胞SRY染色均为阴性。肝细胞癌结节内的肿瘤细胞表达AFP和GST-P，而不表达CK19。胆管细胞癌结节内的肿瘤细胞不表达AFP和GST-P，而表达CK19。结果说明本实验中移植的胚胎肝干细胞转变为肝细胞性肝癌，并且保持了胚胎肝干细胞未成熟的特征，如仍表达GST-P和AFP。这些结果显示移植的胚胎肝干细胞直接癌变形成肝细胞癌。 结论：低剂量的DEN能诱发肝癌，操作方便，周期短，诱癌率高。在DEN诱癌模型中，移植的胚胎肝干细胞癌变形成肝细胞癌。为肝细胞癌起源于肝干细胞提供实验证据。另外，诱癌环境下肝干细胞有癌变的潜能，肝干细胞应用的安全性需要进一步研究。