辣木叶黄酮的提取、分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

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辣木为辣木科辣木属热带多年生落叶乔木,原产于印度西北部的喜马拉雅山南麓,不仅可食用而且具有巨大的药用价值,被称为"神奇之树"。近年来,辣木在我国广东、广西、云南等西南省份得到广泛种植。辣木叶于2012年被我国卫生部门公布为新资源食品,黄酮类化合物是其重要的功能性成分之一。辣木叶黄酮(flavonoidsfrom Moringa oleifera Lam.leaves,FML)具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗癌等多种生理活性,可以开发成保健食品、临床药物、天然防腐剂等,应用前景广阔。本论文以FML为研究对象,优化了其提取、分离纯化工艺,初步分析了其结构,并对其抗氧化、抑菌、抑制胰脂肪酶和αα-葡萄糖苷酶的生物活性进行了研究。本论文主要研究内容及结论如下:1.利用响应面分析法对微波辅助提取FML的工艺进行优化。以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取功率为影响因素,以黄酮提取率为响应值,在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken原理设计了一组4因素3水平实验。对29组实验数据进行拟合及统计学分析,得出最佳的提取条件为:提取时间308 s,提取功率302 W,乙醇浓度75%,料液比1:52 g/mL,在此优化条件下,黄酮的提取率为5.530%,和模型预测值5.69%十分接近。2.采用大孔树脂色谱柱和聚酰胺色谱柱联用的工艺对FML进行分离纯化。从6种极性不同的大孔树脂中筛选出AB-8型适合用于FML的分离纯化,并研究了其静态吸附动力及热力学特征。对色谱柱的分离纯化工艺进行了优化,得到AB-8型大孔色谱柱的最优条件为:上样浓度为7mg/mL,上样流速为2BV/h,上样体积为1BV,洗脱液为70%乙醇溶液,洗脱液流速为2 BV/h,洗脱液体积为2.5 BV;聚酰胺色谱柱的最优条件为:上样浓度为4 mg/mL,上样流速为1.5 BV/h,上样体积为1 BV,洗脱液浓度为70%,洗脱液流速为1.5 BV/h,洗脱液体积为3 BV。纯化后FML浸膏中黄酮的含量由13.38%提高到76.45%,并用HPLC测定了纯化前后FML中芦丁的含量,验证了分离纯化的效果。3.用UPLC-Q-Orbitrap MS液质联用技术对纯化后的FML结构进行定性分析和鉴定。根据色谱和质谱信息,参考相关文献,分析鉴定出11个黄酮类化合物和2个酚酸类化合物,分别为:蔷薇苷、芦丁、牡荆素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6-丙二酰基葡萄糖苷)、槲皮素-3-O-羟甲基戊二酰基半乳糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-乙酰基葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二酰基己糖苷、山奈酚-3-O-羟甲基戊二酰基己糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷,3-咖啡酰奎宁酸和4-咖啡酰奎宁酸。4.通过测定纯化前后的FML对DPPH自由、羟基自由的基清除能力及还原能力来评价其抗氧化能力,通过测定抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)来研究其抑菌活性。未纯化、纯化的FML对DPPH的半数清除浓度(EC5G)分别为:0.03mg/mL、0.438 mg/mL,对羟基自由基的 EC50 分别为:0.054 mg/mL、0.874 mg/mL,0.075 mg/mL纯化的FML与0.048 mg/mL Vc具有相当的还原能力。未纯化的FML对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌有抑制作用,20 mg/mL时的最大抑菌圈直径分别为16.71、10.66、15.77 mm,MIC分别为10、5、10 mg/mL,对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌无抑制。纯化后的FML对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌具有较好的抑制作用,20 mg/mL时最大抑菌圈直径分别为21.59、17.80、20.91、23.94mm,MIC 分别为 1.250、2.500、0.625、1.250mg/mL,对铜绿假单胞菌无抑制作用。纯化后FML的抗氧能力和抑菌活性好于纯化前。5.用PNPP和PNPG法,分别测定FML对胰脂肪酶和0α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并通过Lineweaver-Burk双倒数作图法判断它们的抑制作用类型。结果表明纯化后的FML对胰脂肪酶具有较好的抑制作用,半数抑制浓度(IC50)为0.86 mg/mL,为非竞争性抑制;对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,IC50为4.18 mg/mL,为竞争性抑制。
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