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目的:(1)评估静电纺丝技术制备的一种取向排列的聚乳酸(polylactic acid,PLA)纳米支架作为组织工程韧带支架的可行性及优势;(2)观察纳米纤维排列和单轴拉伸对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)骨架和分化的影响;(3)探讨分析Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)和局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在纳米纤维排列和单轴拉伸诱导BMSCs向韧带样细胞分化过程中的作用。方法:(1)全骨髓贴壁法获取兔BMSCs,检测其成骨、成脂分化潜能和表面抗原表达情况。(2)静电纺丝技术制备取向和无规排列的纳米纤维支架,检测其力学特性和生物相容性。(3)BMSCs分别在静态和拉伸条件下在取向和无规纳米纤维支架上培养7天后,通过F-actin荧光染色观察BMSCs的骨架变化。添加ROCK抑制剂(Y-27632)后,BMSCs分别在静态和拉伸条件下在纳米纤维支架上培养7天后,观察BMSCs的骨架变化。(4)BMSCs分别在静态和拉伸条件下在取向和无规纳米纤维支架上培养7天后,RT-PCR技术检测取向和无规纳米支架上BMSCs韧带分化相关基因mRNA(COL1A2、COL3A1、Tenomodulin、Tenascin C)、ROCK和FAK基因mRNA表达水平。给予Y-27632后,检测上述基因mRNA表达的水平。(5)BMSCs分别在静态和拉伸条件下在取向和无规纳米纤维支架上培养7天后,Western blot技术检测取向和无规纳米支架上BMSCs韧带相关蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ、Tenomodulin、Tenascin C)、FAK、ROCK和成骨相关蛋白RUNX2的表达水平。给予Y-27632后,检测上述蛋白表达的水平。结果:(1)全骨髓贴壁法获取的兔BMSCs增殖能力良好,能稳定向成骨和成脂分化,其表面抗原的表达也符合BMSCs的特征。(2)静电纺丝技术制备的PLA取向纳米纤维支架生物相容性好,力学强度接近人体韧带。(3)静态条件下,取向支架上细胞骨架平行于纤维排布方向伸展,细胞呈梭形,无规支架上细胞骨架随意伸展,细胞呈多角形,给予Y-27632后,抑制了取向支架上细胞骨架平行于纤维排布方向伸展;拉伸条件下,细胞骨架沿拉伸方向平行伸展,给予Y-27632后,明显抑制了细胞骨架沿拉伸方向伸展。(4)静态条件下,与无规纳米支架相比,取向纳米支架上BMSCs韧带分化相关基因mRNA(COL3A1、Tenomodulin、Tenascin C)表达上升(P<0.01),ROCK和FAK基因mRNA表达明显上升(P<0.01)。单轴拉伸条件下,与静态纤维支架相比,拉伸纤维支架上BMSCs韧带分化相关基因mRNA(COL1A2、COL3A1、Tenomodulin)表达上升(P<0.01),ROCK和FAK基因mRNA表达也上升(P<0.05)。给予Y-27632后,上述基因mRNA表达水平下降。(5)静态条件下,与无规纳米支架相比,取向纳米支架上BMSCs韧带相关蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ、Tenascin C)的表达上升,ROCK表达也明显上升(P<0.05),成骨相关蛋白RUNX2表达下降。单轴拉伸条件下,与静态纤维支架相比,拉伸纤维支架上BMSCs韧带分化相关蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ、Tenascin C)表达上升(P<0.05),ROCK和FAK的表达上升(P<0.05),成骨相关蛋白RUNX2表达明显下降(P<0.01)。给予Y-27632后,上述蛋白表达水平下降。结论:(1)通过静电纺丝技术以PLA材料制备的取向纳米纤维支架具有良好的生物力学强度,其表面的BMSCs能够仿照韧带组织中的细胞排列并同向拉伸,具备向韧带样细胞分化的潜能,可作为组织工程韧带的理想支架。(2)单轴拉伸联合取向纳米纤维诱导BMSCs分化过程中,细胞骨架的变化可能是调控BMSCs向韧带系分化的早期细胞内结构信号之一。(3)体外小幅度低频率周期性单轴拉伸刺激联合取向纳米支架能促进BMSCs向韧带系分化,FAK和ROCK可能参与纳米纤维排列与机械刺激诱导BMSCs向韧带样细胞分化的过程,但具体机制需要进一步研究。