为进一步探究‘凤丹’种子休眠和萌发的分子机制,本文以萌发过程中不同时期的‘凤丹’种胚为材料,研究其生理生化指标,比较其蛋白条带差异,并鉴定这些差异蛋白种类,分析这些差异蛋白的基因表达模式。其中对鉴定出热激蛋白70基因进行克隆,并进行生物信息学分析和表达模式分析,揭示HSP70基因在‘凤丹’种子萌发过程中的表达机制。1.‘凤丹’种胚生理生化特性研究‘凤丹’种胚的吸胀和生活力测定结果表明,完成生理后熟的‘凤丹’种子在吸胀2 d后再进行播种,可大大提高‘凤丹’种子的出芽率。酶活性结果说明,在干胚时期,‘凤丹’种子内活性氧自由基和过氧化氢的含量较高。在吸胀完全时,‘凤丹’种胚内此时多酚类物质含量较高。在种子萌发的过程中,种子中油脂类物质在逐渐分解,为种子萌发提供养料和能量。在种子胚根形成期间,‘凤丹’种胚内IAAO活性下降导致IAA含量上升,以促进‘凤丹’种子的生根。在胚根伸长至3cm时,胚根已经开始了木质化或者木质化程度增加。在经赤霉素处理后,‘凤丹’种胚中有大量的α-淀粉酶的合成以及大量的淀粉被分解供能,以满足种子萌发需要;同时,此时种子受到过氧化氢的影响较大。2.不同处理的‘凤丹’种胚的质谱鉴定通过‘凤丹’种子蛋白质的单向电泳,发现其SDS-PAGE图谱在86.2 KDa、76.4 KDa、60.4 KDa和56 KDa蛋白质条带处有明显的差异,推测这些蛋白通过转化为其他物质参与了‘凤丹’种子萌发过程。对‘凤丹’种子萌发过程中的差异条带进行LC-MS鉴定,共鉴定出31种已知蛋白质。这些蛋白质可分为6个功能类别,包括蛋白翻译信号转导,花色调控,非生物胁迫,细胞器基因加工,细胞成分。其中最大的功能类别是能量和物质代谢(35.48%),共有11种蛋白质参与了糖代谢的过程、TCA循环、脂类代谢和物质的合成。3.‘凤丹’种子差异蛋白的基因表达模式分析对鉴定出的‘凤丹’种子萌发时期的相关蛋白的基因进行基因表达模式分析后发现,大部分基因表达量的上升都集中在胚根伸长时期,其中MDH、G6PDH等11个基因在胚根伸长5 cm时表达量最高,推测可能是因为在胚根伸长时期,细胞的各项生命活动比较旺盛,其基因的表达比较活跃;同时,发现一些和‘凤丹’种子萌发有密切关系的基因,如F7GT、HSP70、6PGDH、G6PDH、MDH、IDH、FAD2、L3A3等基因,它们表达量的变化影响种子萌发时物质和能量代谢等过程,促进种子最终的萌发。4.PoHSP70基因的克隆和表达模式分析根据本课题组牡丹转录组数据库信息,以干种子胚的总RNA为材料进行HSP70基因的克隆,得到一条长约1953 bp左右的条带,共编码650个氨基酸,命名为PoHSP70。PoHSP70蛋白具有亲水性,不是分泌蛋白,也不是跨膜蛋白。其同源性分析结果表明,植物中的HSP70基因高度保守,但C端差异较大。在PoHSP70的C-末端发现了胞质区特征基序:GPKIEEVD,说明PoHSP70可能位于细胞的细胞质中。PoHSP70基因进化树结果表明,‘凤丹’PoHSP70基因和革质花盘亚组观赏牡丹HSP70基因的亲缘关系最近,和芍药的亲缘关系次之。PoHSP70基因的表达分析结果表明,PoHSP70基因在‘凤丹’种子胚根和胚轴伸长时期高表达,同时,热激蛋白70在‘凤丹’种子吸胀2 d后大量合成,加快‘凤丹’种子的萌发;在种子萌发后,PoHSP70基因的表达量回归于正常水平。