肺癌是目前世界上死亡率第一的恶性肿瘤,虽然手术、放化疗等治疗手段已经取得了长足的发展,但是肺癌总体5年生存率仅为15%。非小细胞肺癌（NSCLC）占据肺癌总数的80%-85%,近年来以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的分子靶向治疗成为临床治疗NSCLC的重要手段,并且呈现很好的疗效。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）是目前治疗NSCLC最重要的一类分子靶向药物,包括厄洛替尼和吉非替尼。临床研究发现,绝大多数对厄洛替尼和吉非替尼敏感的病人都携带EGFR敏感突变,最常见的突变是19号外显子缺失或是21号外显子L858R点突变。但是此类NSCLC患者在用药后不久都会产生耐药反应,耐药原因主要是EGFR第20号外显子上的第790位苏氨酸突变为甲硫氨酸（T790M）,该突变使得EGFR对EGFR-TKI的亲和性大大下降,药物不再有效,因而形成获得性耐药。尽管有研究致力于开发针对T790M抗性突变的新一代EGFR-TKI,但是这些药物仍处于研究阶段,并且由于它们有较大的毒副作用以及与EGFR结合能力较弱,这些靶向药物距离临床应用还有很大距离。如果能够深入认识产生EGFR-TKI获得性耐受的过程,从细胞分子水平阐明造成耐药基因突变的原因和机制,对于阻止敏感型NSCLC患者产生EGFR-TKI药物耐受具有重要意义,从而有望明显改变肺癌病人生存时间短和治疗乏术的状态。机体内的细胞每天都会在内、外源刺激下产生成千上万的DNA损伤,碱基切除修复（base excision repair,BER）途径是真核生物非常保守和重要的DNA修复机制之一,特别针对DNA上受损和错误出现的碱基进行清除。削弱BER途径的修复能力会造成DNA复制时掺入错误配对的碱基,导致基因突变。由于EGFR T790M抗性突变是碱基C被T错配形成的,因此我们推测:EGFR产生抗性突变与细胞内BER的修复能力有关。热休克蛋白70（HSP70）是非常重要的一种细胞内源性保护蛋白,其基本功能是作为分子伴侣协助新生多肽折叠、多蛋白复合物的组装、跨膜蛋白运输及错误蛋白的降解。近期研究表明,HSP70还具有保护DNA的作用,过表达HSP70能减少紫外线或离子辐射诱导的DNA损伤,该作用可能是HSP70通过促进BER途径的修复酶的活性而实现的,但具体机理仍待阐明。直至目前,有关HSP70参与DNA损伤修复的研究甚少,为此,本研究进一步揭示了 HSP70对BER途径的调节机制,并探索了 HSP70介导的BER修复能力与产生EGFR抗性突变的关系。本研究的主要结果有:1.使用低剂量EGFR-TKI长时间处理对该药物敏感的NSCLC细胞系——HCC827细胞,利用PCR结合DNA测序的方法检测发现,原本只携带EGFR敏感突变的细胞中出现了 EGFR T790M抗性突变;2.低剂量EGFR-TKI药物处理明显削弱了细胞内BER的反应效率,并且还导致HSP70蛋白明显减少;3.在EGFR-TKI敏感型HCC827细胞中过表达HSP70蛋白,可以减少药物处理造成的DNA损伤;使用低剂量药物长时间处理稳定过表达HSP70的HCC827细胞,利用HPRT和T790M突变检测实验,与对照细胞比较,过表达HSP70能显著抑制药物处理诱导的基因突变率增加,并且明显延缓了 HCC827细胞中出现EGFR T790M抗性突变;4.HSP70能分别与BER途径中的关键修复酶DNA聚合酶β（Polβ）和flap核酸内切酶1（FEN1）结合,重组的HSP70不仅可以促进FEN1的酶活,还可以促进Pol β的聚合酶保真性,从而提高BER的修复效率和修复准确性,减少基因突变;5.EGFR-TKI药物通过抑制EGFR信号通路,改变了 HSP70的磷酸化修饰状态（药物处理抑制了 HSP70第41位酪氨酸的磷酸化）,导致HSP70泛素化水平增加,最终引起HSP70通过泛素-蛋白酶体途径被降解,因此出现HSP70蛋白减少的现象。基于以上结果,我们认为:当EGFR-TKI敏感型NSCLC细胞接受药物治疗后,引发HSP70蛋白降解,进而使HSP70介导的BER途径的修复能力减弱,增加了基因突变率,尤其是增加了用药后EGFR发生T790M抗性突变的机率,而这些表达具有抗性突变EGFR的肿瘤细胞在药物治疗过程中被保留下来,将最终形成耐药的肿瘤。本研究揭示HSP70通过BER途径减少基因突变的作用,深入认识肿瘤细胞中HSP70蛋白的功能,并且针对临床EGFR敏感突变的NSCLC应用EGFR-TKI后产生获得性耐受这一治疗“瓶颈”,研究耐药形成的可能机制,有助于我们探索克服耐药的方法和思路,提高靶向药物的临床疗效,具有临床参考价值。