副溶血弧菌（Vibrio parahaemolytics）广泛分布于海水及海产品中，尤其是在海产贝类中。流行病学调查显示该菌是引起我国沿海地区食物中毒的主要致病菌，人们通常由于食用了生的或者加热不彻底的海产贝类而感染副溶血弧菌，并引起肠胃炎，中毒症状多为头疼、腹泻、呕吐反胃、胃部痉挛和发低烧，少数情况下可引起败血症，进而导致死亡。近年来，在我国食用贝类而感染副溶血弧菌的事件时有发生，给人们身体健康带来巨大威胁，也给贝类养殖业造成巨大损失。我国是贝类养殖大国，2009年海水贝类产量达1072万吨，而东部沿海省份（山东、江苏、浙江、福建）是我国贝类的主产区，产量占全国贝类总产量的60％左右。因此调查我国东部沿海地区贝类中副溶血弧菌的分布情况，建立致病与非致病性副溶血弧菌的分型方法，开展贝类中副溶血弧菌的风险评估等研究，对保护消费者健康和保障我国贝类产业可持续健康发展具有重要的意义。　　本文优化建立了贝类中副溶血弧菌的定量检测方法;对东部沿海城市贝类中副溶血弧菌的分布及特征状况进行了调查;针对分离的菌株，系统运用现代分子生物学技术，建立了副溶血弧菌的分子分型方法;并在上述工作的基础上，开展了贝类中副溶血弧菌的半定量和定量风险评估。具体研究结果如下:　　1.副溶血弧菌检测方法的建立与优化　　将常规微生物分离方法和PCR方法相结合，建立了副溶血弧菌的MPN-PCR检测方法。本方法同国标方法（GB/T4789.7-2008）相近，首先采用TCBS对副溶血弧菌进行分离，但使用PCR方法对可疑菌落进行鉴定，再结合MPN统计方法对样品中的副溶血弧菌进行定量。与直接PCR相比，可以减少增菌液中杂菌影响，避免了因其它杂菌的存在而导致PCR假阳性结果的出现，同时可得到纯菌落，利于副溶血弧菌的后续研究。该方法同国标方法相比，检测时间缩短了2～3天。　　利用副溶血弧菌的双重PCR检测方法，结合酶联免疫反应(ELISA)的方法，建立了副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法。该方法利用双链DNA互补结合的特点，设计了tlh和tdh基因的特异性探针，并利用生物素对探针进行标记，探针同地高辛标记的PCR产物特异性结合后，经显色液显色，可对样品进行区分和定量。该方法提高了PCR检测方法的特异性，可以对样品进行定量分析，成本低廉，适合高通量的检测分析。该方法在标准品的浓度高于104 copies/μL时，用肉眼可直接观察到阳性结果，在标准品的浓度为102-106 copies/μL时，线性关系良好，可用于样品的定量分析。　　2.东部沿海城市贝类中副溶血弧菌的分布及致病性研究　　从2008年12月至2009年11月，采集了烟台、威海、青岛、连云港、舟山和厦门六个东部沿海城市的贝类样品288个，其中牡蛎80个、菲律宾蛤仔72个、栉孔扇贝70个、紫贻贝66个。调查结果显示:有172个样品检出副溶血弧菌阳性，检出率为59.72％，平均浓度为351.55 MPN/g。副溶血弧菌在贝类中的分布存在季节和地域差异，但四种贝类之间不存在差异。表明副溶血弧菌的分布主要受环境因素影响，且温度的影响最大。　　分离的副溶血弧菌的血清分型结果显示:172株菌中有155株可以区分其O群，其中O3群的菌株数最多，共有33株，占分离菌株总数的19.2％;仅有42株菌可区分其K型，存在大量K型无法区分的菌株。毒力检测结果显示172株菌中有2株携带tdh基因，5株携带trh基因。其中2株tdh阳性菌有溶血现象，5株trh阳性菌不产生溶血现象，表明2株tdh阳性菌具有致病性。　　3.副溶血弧菌的分子分型方法研究　　比较了RAPD和ERIC-PCR两种分型方法，结果显示，RAPD可将供试的24株副溶血弧菌分为13个群，分辨力指数达0.931; ERIC-PCR可将24株副溶血弧菌分为10个群，分辨力指数达0.859。RAPD产生的带型清晰，多态性高，RAPD分析方法操作简便，耗时短，便于进行大规模的样品分析，而且RAPD是在基因水平上对副溶血弧菌进行分型，其结果能反应副溶血弧菌的亲缘关系及进化特征。RAPD方法同PFGE方法相比，需要DNA的量少，对仪器设备的要求也较低，便于在不同层次的实验室推广，是一种有效的副溶血弧菌的分子分型方法，可应用于食品溯源以及流行病学调查等方面的研究。　　利用建立的RAPD方法对172株菌进行了分型，结果显示172株副溶血弧菌共有73种不同的带型。聚类分析结果显示在相似系数为0.85时，172株副溶血弧菌分别归属于18个RAPD类群，不存在无法区分的菌落。　　本文分离得到了2株tdh阳性株，其血清型分别为O3∶K6和O4∶K68，经RAPD分析显示，这2株菌和CDC提供的2个临床分离株具有相似的带型，归属于同一RAPD类群。表明O3∶K6及其相关血清型仍是副溶血弧菌的主要致病类型，同时也说明该RAPD方法能有效地将强致病性副溶血弧菌同其他菌株区分离开来。　　利用AFLP技术对分离得到的8个O群的副溶血弧菌做了进一步分析。获得了84个在不同O群中差异的片段，四种引物组合E-T/M-T，E-C/M-C，E-C/M-G和E-G/M-C产生的差异的片段数量最多。根据有差异的片段设计引物，筛选得到了8个SCAR标记，可以区分不同的O群。　　4.副溶血弧菌的半定量风险评估研究　　本文利用Risk Ranger软件对鱼类、虾类和贝类中的副溶血弧菌做了半定量风险评估，结果显示贝类中副溶血弧菌的风险明显高于其它两种产品，在资源有限的情况下，可以优先进行贝类中副溶血弧菌的定量风险评估。　　通过评估发现:如果在贝类销售前采取适当的控制手段，可降低感染副溶血弧菌的风险;另一重要措施就是食用前的准备过程。在其它条件不变的情况下，仅在“食用前彻底加热”就可完全消除，风险值就为0，因此，食用前的准备非常重要，建议消费者在食用贝类前将其充分加热。　　5.贝类中副溶血弧菌的定量风险评估　　收集了贝类中副溶血弧菌定量数据839个，结合CAC的食品安全风险分析理论和基于蒙特卡罗技术的@Risk定量风险评估软件开展了贝类中副溶血弧菌的定量风险评估研究。暴露评估的结果显示:六个城市的居民在不同季节因食用贝类摄入的致病性副溶血弧菌的数量存在差别，夏季和秋季的暴露量明显高于春季和冬季，六个城市的居民在春季、夏季、秋季和冬季的每餐暴露量的平均值分别为13.37个、62.40个、59.98个和12.9个副溶血弧菌;不同城市之间的暴露量也存在差异，舟山和厦门的暴露量明显高于其他城市，其中最高的暴露量出现在夏季的舟山，平均暴露量为83.07个，最低的则为冬季的青岛，平均暴露量为6.66个。敏感性分析结果显示:各个变量因素对暴露量的影响各不相同，对暴露量影响最大的是贝类中副溶血弧菌含量，其次为每餐消费量和城市的气温，贮藏时间的影响最小，其中气温对居民暴露量的斯皮尔曼等级相关系数在夏季为0.22，秋季为0.18，春季为0.10，冬季则为-01.0，表明气温对暴露量的影响在春、夏、秋季为正相关，冬季则为负相关。　　风险评估的结果显示，夏季和秋季六个城市居民因食用贝类引发肠胃炎的概率明显高于春季和冬季，春季、夏季、秋季和冬季发病概率的平均值分别为6.19×10-6、3.76×10-5、2.58×10-5和5.49×10-5。六个城市在夏季的发病概率分别为:烟台(1.39×10-5)、威海(2.84×10-5)、青岛（2.98×10-5）、连云港（2.84×10-5）、舟山(3.76×10-5)、厦门（3.42×10-5）。不同城市之间的发病概率也存在着差异，总体上说南方城市（舟山和厦门）要高于其他城市，发病概率最高的为舟山市的夏季为3.76×10-5，最低的为青岛市的冬季为2.88×10-6。