传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、病毒性疾病,主要侵害呼吸和泌尿生殖系统。该病在世界范围内广泛流行,给养禽业造成严重的经济损失。传染性支气管炎病毒（IBV）的基因型众多,可分为Ⅰ～Ⅵ群及不同亚群,其中GVI-1基因型（又称TC07-2型）毒株于2007年在我国广东省首次被分离鉴定,随后在亚洲其他一些国家相继出现。流行病学监测显示,近年来GVI-1基因型IBV毒株的分离率持续上升,尤其在中国南方地区更为普遍。本研究建立了 GVI-1型IBV毒株的RT-qPCR检测方法,评价了该型毒株对雏鸡及产蛋鸡的致病性,并且培育了具有良好安全性和免疫保护效果的弱毒疫苗候选株。这对于GVI-1型IBV的监测和防控具有重要意义。1.GVI-1型传染性支气管炎病毒的RT-qPCR检测方法建立为快速鉴别GVI-1基因型IBV毒株与其他基因型IBV毒株,根据不同基因型毒株S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针,建立了检测GVI-1基因型毒株的RT-qPCR方法。该方法在1.0×1010～1.0×101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数（R2）为0.999;对质粒标准品的检测下限可达1.0×101拷贝/μL;与GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-28等其它基因型毒株均无交叉反应;组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%。应用该方法和常规PCR方法对人工感染雏鸡的口腔和泄殖腔拭子进行检测,两者的符合率为96.7%,且RT-qPCR方法的阳性检出率更高。本研究建立的GVI-1基因型IBV RT-qPCR检测方法的灵敏度高,特异性强,可重复性好,对GVI-1基因型IBV的流行病学监测和临床分离株的快速筛查具有重要意义。2.GVI-1型IBV毒株的致病性评价试验一:将80只10日龄的SPF雏鸡（母鸡）随机分为攻毒组和对照组,每组40只。攻毒组每只鸡通过滴鼻点眼接种0.1 mL（106.5EID50）GVI-1基因型IBV CK/CH/JX/2018/1（JX181）毒株,对照组接种等量PBS。每天观察鸡的临床症状,定期剖检,并采集组织样品进行病毒载量的检测和病理组织学检查;定期采集口腔和泄殖腔拭子,进行排毒检测。试验鸡产蛋后,对每天的产蛋数量和蛋品质参数进行记录和测定。180日龄时,对所有实验鸡安乐死并尸检。结果显示,接种GVI-1基因型IBV后雏鸡出现严重的呼吸道症状,喉头气管和法氏囊出血、肺充血及输卵管囊性水肿;组织病变主要发生在攻毒后第6～9天,雏鸡气管纤毛丢失、上皮细胞脱落、黏膜固有层有淋巴细胞浸润,肺支气管出血,脾窦内巨噬细胞数量增多,肾小管上皮细胞肿胀、坏死,法氏囊淋巴滤泡萎缩、间质扩张;GVI-1基因型IBV可在气管、肺、脾、肾和法氏囊等多种组织中复制,以气管的病毒载量最高,口腔和泄殖腔拭子中都可以检测到排毒,且通过口腔排毒量更高,排毒持续时间更长。剖检发现,180日龄时攻毒组母鸡出现卵巢炎症、体腔内有液状卵黄物质或纤维蛋白凝块、输卵管囊肿、输卵管和卵巢发育迟缓;此外攻毒组产蛋量相较对照组下降了 15.1%。结果表明,GVI-1型IBV具有广泛的组织嗜性,母鸡感染后可影响卵巢和输卵管发育,对输卵管造成永久性损伤,造成产蛋量下降。试验二:将8只200日龄产蛋母鸡随机分为攻毒组和对照组,每组4只。攻毒组每只鸡通过滴鼻点眼接种0.1 mL（106.5EID50）GVI-1基因型IBV CK/CH/JX/2018/1（JX181）毒株,对照组接种等量PBS。每天观察鸡的临床症状,对每天的产蛋数量和蛋品质参数进行记录和测定,于攻毒后第4天和第8天每组随机抽取两只鸡进行剖检并采集输卵管漏斗部、膨大部、峡部及子宫部进行病毒载量的检测、病理组织学检查和免疫组织化学分析。结果显示,GVI-1型IBV毒株可引起母鸡呼吸困难、气管啰音等临床症状,导致蛋品质下降,浓蛋白稀薄,血肉斑比例增加,蛋壳变薄等;剖检显示感染母鸡喉头气管出血、肺充血,输卵管黏膜褶皱变平、管壁变薄、管腔内有异物;病理组织学检查显示,攻毒组母鸡输卵管管状腺结构被破坏,管状腺细胞退化,黏膜固有层水肿;病毒可在输卵管的所有节段中复制,复制能力由强到弱依次为输卵管漏斗部、子宫部、峡部和膨大部,与免疫组织化学试验着色强度一致。结果表明,GVI-1型IBV对产蛋母鸡的输卵管具有强烈嗜性,可造成输卵管严重损伤,引起蛋品质降低。3.GVI-1基因型IBV弱毒株的培育及其安全性和免疫效力的初步评价为研发针对GVI-1型IBV的新型弱毒疫苗,将GVI-1型IBV JX181株在SPF鸡胚上进行连续传代,传至5代次、95代次和115代次的毒株分别命名为JXP5株、JXP95株和JXP115株。本研究建立了 JXP5株的攻毒模型,并对JXP95和JXP115的安全性和免疫保护性进行初步评价。JXP5株可引起雏鸡典型的IBV临床症状,对气管、肺、肾、法氏囊和输卵管等组织均可造成损伤,JXP95毒株不引起鸡的临床症状,但可导致喉头轻微出血,气管粘膜固有层增厚和淋巴细胞浸润,肺支气管腔内偶尔有少量红细胞浸润和法氏囊淋巴滤泡间质扩张,而接种JXP115毒株的雏鸡无任何临床症状和肉眼病变,仅可见气管粘膜固有层有少量淋巴细胞浸润。扫描电镜观察显示,JXP5株可导致鸡气管纤毛大面积脱落,JXP95株引起的气管纤毛损伤较轻,而接种JXP115气管纤毛完整。通过RT-qPCR检测各组织中的病毒载量发现,JXP95和JXP115毒株的复制能力显著低于JXP5株。免疫保护性实验显示,JXP95和JXP115毒株免疫组的雏鸡在用JXP5株攻毒时均不出现临床症状,气管纤毛完整、活力良好,而非免攻毒组临床症状严重,气管纤毛脱落、运动停滞;JXP95和JXP115免疫组口腔和泄殖腔的排毒量和排毒持续时间均显著低于未免疫组。上述结果表明,IBV JX181毒株在鸡胚上传至95代次时仍可对雏鸡的组织器官造成轻微损伤,而115代次毒株的致病力充分降低且仍保留良好免疫原性。因此,JXP115是一株良好的GVI-1型IBV弱毒疫苗候选株。