研究背景：湿疹是由多种内、外因素引起的真皮浅层及表皮炎症。病因复杂，一般认为是由多种内、外因素相互作用所致，其发病机制可能与迟发型变态反应有关(1)。而迟发型变态反应，有多种细胞因子参与，尤其是2型辅助性T细胞(Thelpercell，Th2)因子，如白细胞介素4(Interleukin4，IL-4)，白细胞介素10(Interleukin10，IL-10)，白细胞介素13(Interleukin13，IL-13)等，可促进反应进行。1型辅助性T细胞(Thelper1，Th1)因子，如γ-干扰素(Interferonγ，IFN-γ)，白细胞介素2(Interleukin2，IL-2)等可抑制该反应的进行。 白细胞介素18(Interleukin18，IL-18)是新近发现的一种细胞因子，最初认为其是IFN-γ诱导因子，与IL-12共同作用可增强IFN-γ基因的表达(2-4)，增强Th1细胞介导的细胞免疫应答反应(6)。后来大量研究发现，IL-18也可诱导Th2型细胞因子、免疫球蛋白E(ImmunoglobulinE，IgE)及免疫球蛋白G1(ImmunoglobulinG1，IgG1)的产生(7-12)。Yoshimoto等研究发现IL-18可刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生Th2型细胞因子和组织胺，后二者均可诱导和加重迟发型超敏反应(13)。建立血清高水平IL-18皮肤特异性半胱天冬酶1(Caspase-1)转基因鼠，可以检测到其血清中存在高水平的IgE(14)。研究发现，在鼠模型中，利用抗原和IL-18共同刺激被动转移的Th1型记忆淋巴细胞，可以产生Th1、Th2型细胞因子，继而诱导气道炎症和皮肤超敏反应。HidenoriOhnishi等检测51名具有过敏素质的儿童血清中IL-18，其水平显著高于健康儿童组(15)。李燕等检测支气管哮喘患者血清中IL-18水平也显著高于健康对照组(16)。这些研究表明，IL-18与过敏性疾病密切相关。到目前为止，查阅国内外有关资料，未见关于IL-18与慢性湿疹的相关性研究。本研究联合测定皮肤和血清中IL-18、IFN-γ的水平，与正常对照比较，并对其与慢性湿疹患者病情评分的相关性进行研究，以探讨IL-18在慢性湿疹发病机制中的作用。 研究目的：检测慢性湿疹患者皮损中IL-18mRNA、IFN-γmRNA水平；血清中IL-18蛋白、IFN-γ蛋白水平；分析皮损与血清中IL-18的水平与湿疹病情评分的关系，探讨IL-18在慢性湿疹发病中的作用。 材料和方法：1、研究对象1.1确定病人入选标准：1.1.1病程超过6周；1.1.2病因不明；1.1.3皮疹以苔藓样变为主，有渗出史；1.1.4瘙痒剧烈；1.1.5对称分布；1.1.6皮肤组织病理符合慢性湿疹改变；1.1.7性别不限，年龄16岁至65岁；1.1.8两周内未使用过抗组胺药物、类固醇激素及免疫抑制药物；1.1.9同意进行皮肤病理活检和抽取静脉血进行该试验。 1.2满足以上标准者均可入选病例组，共27例，其中男性12例，女性15例，最大年龄65岁，最小年龄16岁，平均年龄41±11.9。均为2005年10月至2006年2月中山大学附属第二医院皮肤科病人。 1.3正常对照选取整形外科手术之正常皮肤组织和健康体检者血清。皮肤组织正常对照组12例，男性7例，女性5例，最大年龄56岁，最小年龄24岁，平均年龄36±8.7；血清正常对照组12例，男性6例，女性6例，最大年龄44岁，最小年龄17岁，平均年龄为31±10.3。 1.4各组间年龄和性别构成比差别无统计学意义，具有可比性。 2、实验方法2.1收集标本2.1.1对每例慢性湿疹患者选用典型皮损，按常规皮肤病理活检取材，切取面积1cm×0.5cm梭形皮损。一部分皮损用于病理活检，一部分皮损剪除脂肪组织(重50mg左右)，用DEPC灭菌三蒸水清洗，置于-80℃冰箱待检；正常对照选自整形外科切除的正常皮肤，剪除脂肪组织(重50mg左右)，用DEPC灭菌三蒸水清洗，置于-80℃冰箱待检。 2.1.2按常规抽取外周静脉血4ml，4℃静置1h，4℃，3000r/min离心10min，分装入EP管中，置于-80℃冰箱待检。 2.2用1998年Hanifin提出的“湿疹面积及严重度指数”(EczemaAreaandSeverityIndex，EASI)对慢性湿疹患者的临床表现进行病情评分。 2.3用RT-PCR方法检测皮损中IL-18mRNA、IFN-γmRNA表达水平取-80℃低温保存的皮肤组织标本，在液氮中研磨成粉末，用Trizol(Invitrogen)常规提取总RNA，取10μl总RNA，按试剂盒说明书(Promega)反转录合cDNA，取2μlcDNA加入25μlPCR反应体系进行扩增。PCR扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性30s，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。取5μlPCR产物电泳，用凝胶图像分析软件(UVIgelstartMw)分析，结果以目的条带与β-actin密度比值表示。 2.4用ELISA方法检测血清中IL-18蛋白、IFN-γ蛋白水平将-80℃低温保存的血清标本复溶，严格按试剂盒说明书(IL-18试剂盒为美国R&D公司产品，IFN-γ试剂盒为法国DIACLONE公司产品)进行操作。往已包被了一抗的板条各孔中依次加入二抗和酶标抗体工作液，并加入底物及终止液，显色后在分光光度计中492、450nm处读取吸光值。以标准品不同浓度OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应人IL-18和IFN-γ含量。 3、统计方法结果以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件作独立样本t检验及Pearson相关分析。 结果：1、病例组与对照组皮肤组织IL-18mRNA及IFN-γmRNA表达水平慢性湿疹患者和正常对照皮肤组织均有IL-18mRNA及IFN-γmRNA表达，但在慢性湿疹患者皮损中两者的表达均高于正常对照组，差异具有统计学意义。具体见表1： 2、血清IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平慢性湿疹患者血清IL-18蛋白水平显著高于正常对照组，差异有统计学意义；IFN-γ蛋白均数水平低于正常对照组，但差异无统计学意义。具体见表2： 3、IL-18表达与疾病活动性的关系3.1皮肤组织中IL-18mRNA及IFN-γmRNA的表达量与湿疹病情评分：IL-18mRNA及IFN-γmRNA的表达量与湿疹病情评分均呈正相关(P＜0.01)； 3.2血清中IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平与湿疹病情评分：IL-18蛋白及IFN-γ蛋白水平与湿疹病情评分相关性不明显(P＞0.05)。 4、IL-18与IFN-γ的关系4.1皮肤组织中IL-18mRNA表达量与IFN-γmRNA表达量：IL-18mRNA表达量与IFN-γmRNA表达量呈正相关(P＜0.01)；4.2血清中IL-18蛋白水平与IFN-γ蛋白水平：IL-18蛋白水平与IFN-γ蛋白水平无相关性(P＞0.05)。 结论：1、病例组皮损中IL-18mRNA的表达量和血清中IL-18蛋白水平均显著高于对照组，其中皮损IL-18mRNA的表达量与湿疹病情评分呈正相关，提示IL-18参与了慢性湿疹的发病过程，并与病情相关。 2、病例组皮损中IL-18mRNA的表达量与IFN-γmRNA的表达量呈正相关，提示IL-18在皮损局部参与慢性湿疹发病过程可能与诱导IFN-γ的产生有关；血清中IL-18蛋白水平和IFN-γ蛋白水平之间无明显相关性，提示IL-18在血清中参与慢性湿疹发病过程可能受多种因素的影响。