【摘 要】
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背景及目的:唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）在唾液腺恶性肿瘤中占比30%左右,较强的局部复发、侵袭和远处转移能力导致其预后较差,在发生远处转移的病例中,5年生存率仅20%左右。因此,阐明影响SACC生物学行为的可能机制对临床治疗有重要意义。RAS家族蛋白包括HRAS、KRAS、NRAS,需要经过异戊二烯化（prenylation）后才
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背景及目的:唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）在唾液腺恶性肿瘤中占比30%左右,较强的局部复发、侵袭和远处转移能力导致其预后较差,在发生远处转移的病例中,5年生存率仅20%左右。因此,阐明影响SACC生物学行为的可能机制对临床治疗有重要意义。RAS家族蛋白包括HRAS、KRAS、NRAS,需要经过异戊二烯化（prenylation）后才能够被激活,影响与肿瘤发生发展相关的各类信号通路传递,发挥致癌作用。法尼基转移酶（farnesyltransferase,FTase）作为唯一的修饰酶参与HRAS的异戊二烯化过程。本研究探讨了FTase在SACC进展中发挥的生物学作用,探讨其可能的分子机制,以期为SACC的靶向治疗提供依据。研究方法:1.根据FTase基因组序列设计并构建了三条小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）,选用处于对数生长期的SACC-LM及SACC-83细胞,经脂质体瞬时转染技术沉默FTase,分别命名为FTase-si RNA-1组、FTasesi RNA-2组、FTase-si RNA-3组,另设置阴性对照组（使用NC-si RNA转染）,空白对照组（仅加入转染试剂）。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RealTime Quantitative Polymerase Chain reaction,q RT-PCR）实验验证FTase、HRAS两者转染前后的m RNA表达变化,实验组的三组细胞中沉默效率最高的一组将被筛选出作为实验组用于后续实验。2.Western blot免疫印迹用于检测各组细胞中FTase、HRAS总蛋白以及HRAS膜蛋白表达,RAS/PI3K/AKT信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、p65、pp65（Ser563）,细胞周期相关G1/S特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）、p21,上皮间充质转化相关E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）,基质金属蛋白酶（MMP-9）相对表达量变化。3.分别采用CCK8实验、流式细胞术实验、Transwell侵袭实验及细胞划痕实验验证各组细胞增殖、细胞周期、侵袭及迁移能力等方面的变化。4.采用sh RNA干扰慢病毒载体技术,构建了使FTase稳定表达下调的SACC-LM及SACC-83细胞系,建立裸鼠皮下移植瘤模型,并通过测定移植瘤体质量及体积进行数据分析,吸入麻醉后使用小动物活体成像系统进行摄像分析,检测裸鼠肿瘤原发灶及其他部位GFP表达情况。结果:1.沉默FTase后,q RT-PCR实验结果显示:与对照组相比,实验组各组FTase m RNA表达量均减少（P＜0.05）,HRAS m RNA表达量无显著差异性（P＞0.05）。2.沉默FTase后,Western blot结果显示:与对照组相比,实验组FTase蛋白相对表达量显著减少（P＜0.05）;HRAS总蛋白表达无显著差别（P＞0.05）,HRAS膜蛋白相对表达量降低（P＜0.05）;RAS/PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白AKT、p65相对表达量无明显差异（P＞0.05）,其磷酸化形式p-AKT、pp65（Ser563）蛋白相对表达量减少;上皮间充质转化相关蛋白E-cadherin相对表达量明显上升（P＜0.05）,Vimentin及MMP-9蛋白相对表达量降低（P＜0.05）,细胞周期相关蛋白Cyclin D1相对表达量降低（P＜0.05）,p21相对表达量升高（P＜0.05）。3.沉默FTase后,CCK8、流式细胞术、Transwell及细胞划痕实验分别显示:与对照组相比,实验组细胞增殖能力减弱（P＜0.05）;细胞周期阻滞在G1/S期（P＜0.05）;实验组穿膜细胞数量减少,侵袭能力减低（P＜0.05）;实验组细胞划痕愈合速度减慢,迁移能力降低（P＜0.05）。4.成功建立FTase表达稳定下调的SACC-LM及SACC-83细胞系,构建人唾液腺腺样囊性癌裸鼠皮下移植瘤模型。与对照组相比,实验组移植瘤瘤体质量和体积均有明显下降（P＜0.05）,活体成像系统检测移植瘤质地实性,呈结节状,内可见大小不一囊腔,瘤体内荧光信号强烈。结论:沉默FTase可有效抑制人唾液腺腺样囊性癌细胞SACC-LM和SACC-83增殖、侵袭及迁移能力,其作用可能是通过干扰HRAS膜蛋白的定位,调控RAS/PI3K/AKT信号通路而实现。这提示FTase参与调控SACC细胞增殖、侵袭、迁移等发生发展过程,具有成为唾液腺腺样囊性癌治疗靶点的可能性。
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