【摘 要】
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目的:通过分离、培养、鉴定人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,h DPSCs）,观察转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、三氧化矿物凝聚体（Mineral trioxide aggregate,MTA）单独应用、联合应用对人牙髓干细胞增殖及成骨/成牙本质分化的影响,以期为TGF-β1、MTA促进体外培养人牙
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目的:通过分离、培养、鉴定人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,h DPSCs）,观察转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、三氧化矿物凝聚体（Mineral trioxide aggregate,MTA）单独应用、联合应用对人牙髓干细胞增殖及成骨/成牙本质分化的影响,以期为TGF-β1、MTA促进体外培养人牙髓干细胞的分化提供实验参考。方法:1.收集15-25岁患者因正畸或阻生需拔除的健康完整的前磨牙或第三磨牙,采用改良组织块酶消化法自人离体牙内分离培养出牙髓干细胞,应用流式细胞仪鉴定牙髓干细胞表面标志物;2.人牙髓干细胞经过成骨诱导液诱导14天后,用茜素红对形成的矿化结节进行染色,鉴定细胞成骨分化潜能;人牙髓干细胞经过成脂诱导液诱导14天后,用油红O对形成的脂滴进行染色,鉴定细胞成脂分化的潜能;3.制备TGF-β1溶液和MTA浸提液,采用CCK-8试剂盒（Cell counting kit-8,CCK-8）检测MTA组、TGF-β1组、MTA+TGF-β1组、对照组中人牙髓干细胞的增殖活性;4.采用碱性磷酸酶试剂盒检测MTA组、TGF-β1组、MTA+TGF-β1组、对照组和矿化液诱导组分别经过7、14天培养后人牙髓干细胞中碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）的活性;5.采用实时荧光定量聚酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测各组人牙髓干细胞中成骨/成牙本质分化相关基因牙本质涎磷蛋白（Dentin sialophosphoprotein,DSPP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor2,Runx-2）的m RNA相对表达水平;6.各组数据用统计软件SPSS26.0进行统计学分析。结果:1.成功分离培养出人牙髓干细胞,流式检测结果显示:CD44（92.80%）、CD90（85.49%）表达呈阳性,CD34（0.25%）、CD45（0.12%）表达呈阴性,符合人牙髓干细胞的特征。2.人牙髓干细胞具有成骨分化的潜能,在体外能形成矿化结节,染色后能观察到深红色的矿化结节;人牙髓干细胞具有成脂分化的潜能,在体外形成脂质,染色后能够观察到淡黄色的脂滴。3.CCK-8结果显示:在细胞培养第3、5、7天,相比于对照组,MTA组、TGF-β1组、MTA+TGF-β1组均可上调人牙髓干细胞的增殖活性（P＜0.05）;在第3、5、7天,MTA+TGF-β1组中人牙髓干细胞的增殖活性高于MTA组和TGF-β1组（P＜0.05）;在第5、7天,TGF-β1组中人牙髓干细胞增殖活性高于MTA组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.ALP活性检测结果显示:MTA组、TGF-β1组、MTA+TGF-β1组细胞的ALP活性高于对照组和矿化组（P＜0.05）;MTA+TGF-β1组的ALP活性高于MTA组和TGF-β1组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;矿化组的ALP活性高于对照组（P＜0.05）;在第14天,TGF-β1组比MTA组中细胞的ALP活性高（P＜0.05）。5.q RT-PCR检测结果显示:MTA组、TGF-β1组、MTA+TGF-β1组人牙髓干细胞中成骨/成牙本质基因DSPP、OC、Runx-2的m RNA相对表达水平均高于对照组（P＜0.05）,MTA+TGF-β1组细胞中DSPP、OC、Runx-2的m RNA相对表达水平高于MTA组和TGF-β1组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在第14天,TGF-β1组比MTA组细胞中DSPP、OC、Runx-2的m RNA相对表达水平高（P＜0.05）;在第7天,TGF-β1组比MTA组细胞中OC的m RNA相对表达水平高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.通过改良组织块酶消化法成功分离培养出具有成骨、成脂分化潜能的人牙髓干细胞。2.MTA、TGF-β1能促进人牙髓干细胞增殖,TGF-β1与MTA联合应用的效果优于单独使用。3.TGF-β1与MTA联合应用促进人牙髓干细胞成骨矿化的能力优于单独使用MTA和TGF-β1。4.TGF-β1和MTA均能通过上调DSPP、OC、Runx-2的相对表达水平,促进人牙髓干细胞成骨/成牙本质向分化。TGF-β1与MTA联合应用于人牙髓干细胞,细胞中DSPP、OC、Runx-2的相对表达水平较单独使用TGF-β1和MTA更高。
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