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花生(Arachis hypogaea L.)起源于南美洲,是世界上重要的油料作物之一,在全球许多地区都有种植。花生是我国重要的食用油来源,随着经济水平提高以及人们对于食用油需求量越来越大,对于食用油的品质也更加注重。我国食用油自给率严重不足,长期依赖进口,导致我国油料作物价格走低,种植面积减少,会进一步恶化食用油短缺带来的危害。提高花生产量一直是人们长期关注的研究重点,但是对于花生含油量和花生油品质方面的研究却相对不足。因此如何利用基因工程手段和分子生物技术调节花生油脂合成相关基因、进而提高花生油品质和含油量越来越受到人们的重视。在高等植物中,脂肪酸(fatty acid,FA)的合成主要发生在质体中。FA的转运取决于脂酰酰基载体蛋白硫酯酶的(fatty acyl-ACP thioesterase,FAT)的活性,它水解酰基-ACP释放游离FA和ACP,因此FAT对于控制植物FA含量和组成具有重要作用。本研究从花生栽培种“丰花1号”中克隆得到了2个酰基载体蛋白硫酯酶基因(Ah FATB),对其进行了生物信息学、表达模式以及亚细胞定位分析;转化酵母和拟南芥验证AhFATBs的功能;最后克隆了AhFATBs基因的启动子并构建了GUS-植物表达载体。研究结果如下:(1)为了全面了解花生FAT(Ah FAT)家族基因,本研究对Ah FAT家族基因进行了全基因组生物信息学分析。在花生基因组中共有20个FAT基因,不均匀分布在2个基因组的12条染色体上,由于Araip.T3UA2基因不完整,可能会对分析结果产生一定影响,所以不予分析。通过进化树分析发现,植物FAT广泛存在,是较古老的基因。19个Ah FAT基因分为Ah FATA和Ah FATB两个亚家族,Ah FATA亚家族有2个基因,Ah FATB亚家族有17个基因。Ah FATA家族基因具有6或8个外显子,Ah FATB家族基因结构较为复杂,外显子数目5-8个。Ah FAT家族基因都不具有跨膜结构域但是都具有保守的Acyl-ACP＿TE结构域。对Ah FAT家族基因进行可变剪接分析,结果发现Ah FAT家族基因只有少数发生了可变剪接,约占该家族基因总数的25%,且存在组织特异性表达差异。(2)根据转录组测序得到的序列信息,设计引物从花生栽培种“丰花1号”中克隆得到2个Ah FATB基因,分别命名为Ah FATB2-1和Ah FATB2-2。序列分析发现二者的核苷酸序列相似性达到99.36%,都编码414个氨基酸;氨基酸序列相似性100%。Ah FATB2同其他植物FATB一样都具有典型的Acyl-ACP＿TE保守结构域。系统进化树分析显示花生Ah FATB2-1首先与野生花生种聚在同一分支,表明二者亲缘关系最近;又与大豆、苜蓿、绿豆聚在一起,表明它们具有较近的亲缘关系。(3)AhFATBs的表达模式分析结果显示,2个基因在所有组织中都有表达,但是在不同组织和种子发育不同时期的表达模式具有显著性的差异。在根、茎、叶、花四个不同组织中,2个基因都在花中表达量最高,其次是在根中,在茎和叶中的表达量相对较低。在种子发育的四个时期中,在种子发育前期(15 d和30 d)的表达量都比较高,而在种子发育后期(45 d和60 d)表达量都较低。(4)利用拟南芥原生质体瞬时表达系统对AhFATBs进行亚细胞定位分析,结果显示2个AhFATBs都定位在叶绿体中。(5)构建酵母表达载体对酵母菌株进行遗传转化。用气相色谱法检测各转基因酵母菌株FA含量与组成成分。分析发现重组菌与对照菌的主要FA组成没有发生改变,但FA总量有所提高。转Ah FATB2-1和Ah FATB2-2菌株中,C16:1、C18:0、C18:1的含量提高比较显著,与对照相比,分别提高24.7%、36.5%、56.1%和24.7%、22.6%、50.6%。(6)构建植物过表达载体对拟南芥进行遗传转化。用气相色谱法检测各转基因株系的FA含量与组成成分。分析结果显示,Ah FATB2-1和Ah FATB2-2转基因拟南芥种子相比野生型拟南芥种子的FA总量和主要几种FA含量都有很大的提高,其中FA总含量分别提高了约69.0%、67.8%,两者C16:0和C18:0含量分别为87.5 mg/g干重、19.3 mg/g干重和88.0 mg/g干重、19.5 mg/g干重,比野生型分别提高了5.4和3.5倍。(7)启动子克隆与载体构建克隆得到2个基因的启动子序列,长度分别为1316 bp和1489 bp。序列分析显示二者均具有启动子典型的CAAT-box和TATA-box元件,此外还含有一些光响应元件和与防御、胁迫相关的顺式作用元件。为了验证启动子功能,我们成功构建了GUS-植物表达载体。