【摘 要】
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目的:肝纤维化是由多种因素导致的肝脏损伤修复反应,持续性肝纤维化可逐渐发展为肝硬化甚至癌症。micro RNA（miRNA）是一类由18-24核苷酸分子组成的非编码RNA,研究发现miRNA可参与肝脏疾病的发生及发展。本实验的目的是探索梗阻性肝纤维化中miRNA的差异性表达以及miR-183-5p在肝纤维化中的生物学功能及具体作用机制。方法:收集3例肝内胆管结石诱导的肝纤维化与3例正常肝脏组织标本
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目的:肝纤维化是由多种因素导致的肝脏损伤修复反应,持续性肝纤维化可逐渐发展为肝硬化甚至癌症。micro RNA（miRNA）是一类由18-24核苷酸分子组成的非编码RNA,研究发现miRNA可参与肝脏疾病的发生及发展。本实验的目的是探索梗阻性肝纤维化中miRNA的差异性表达以及miR-183-5p在肝纤维化中的生物学功能及具体作用机制。方法:收集3例肝内胆管结石诱导的肝纤维化与3例正常肝脏组织标本,高通量测序用于检测并鉴定肝组织中差异表达的miRNAs。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测复筛的肝纤维化以及正常肝组织标本的miR-183-5p表达水平。选取雄性Wistar大鼠40只,随机分为4组。假手术组将大鼠胆总管与周围组织分离不做结扎。BDL组大鼠结扎胆总管2周进行造模。miR-183-5p antagomir组经尾静脉注射入miR-183-5p antagomir,control antagomir组采用同样方法注射对照试剂,术后2周处死大鼠取肝脏及血清标本。RT-q PCR检测各组大鼠肝脏中miR-183-5p的水平,HE和Masson染色用来检测肝脏病理变化以及肝脏中胶原沉积情况。血清中总胆红素（TBIL）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平则应用全自动生化分析仪用来测量,蛋白质印迹法（western blot）用来检测肝脏中α-SMA,collagen-I和TIMP-1的水平,使用免疫组织化学法测定肝组织中α-SMA的分布情况。将LX-2细胞分为4组,应用Lipofectamine 2000向LX-2细胞转染miR-183-5p antagomir、control antagomir试剂。RT-q PCR用于检测各组LX-2细胞的miR-183-5p以及α-SMA水平,western blot用于检测各组α-SMA,collagen-I,和TIMP-1的水平,CCK-8试剂盒和流式细胞术评估LX-2的细胞增值能力以及细胞的凋亡情况。miR-183-5p的靶基因则使用miRbase、miRDB和Target Scan系统来预测,RT-q PCR检测人体、大鼠以及细胞中的FOXO1 m RNA表达水平,皮尔逊相关性分析用于鉴别miR-183-5p与FOXO1的关系,使用免疫组织化学法测定大鼠肝组织中FOXO1的分布情况。接下来,双荧光素酶实验用于鉴定miR-183-5p和FOXO1之间的作用关系。然后我们将激活的LX-2细胞分为4组,应用Lipofectamine 2000向LX-2细胞转染miR-183-5p agomir、control agomir试剂以及FOXO1慢病毒（LV-FOXO1）。各组的miR-183-5p、α-SMA表达水平应用RT-q PCR检测,western blot检测各组α-SMA,collagen-I,TIMP-1,FOXO1,TGF-β,p-smad2/3,Smad2和Smad3的蛋白水平,CCK-8试剂盒和流式细胞术评估LX-2的细胞增值能力以及细胞的凋亡情况。结果:在本项研究中,我们应用高通量测序共计鉴定出44个具有统计学差异的miRNAs,包含了26个下调和18个上调miRNAs。而RT-q PCR测得miR-183-5p在复筛的人类纤维化肝组织标本中表达增加,这与之前测序结果相匹配。此外,RT-q PCR结果显示,miR-183-5p在大鼠肝纤维化模型和活化的LX-2细胞中均上调。而miR-183-5p antagomir的应用降低了miR-183-5p的水平,减弱了肝纤维化,下调了体内外的α-SMA,collagen-I,以及TIMP-1的蛋白水平,并抑制了LX-2细胞增殖、促进细胞凋亡。双荧光素酶实验显示:miR-183-5p通过直接结合其3’-UTR抑制FOXO1的表达。接下来,我们发现LV-FOXO1可以在LX-2细胞中过度表达FOXO1,而FOXO1的过度表达逆转了miR-183-5p对肝纤维化的促进作用,下调了各组LX-2细胞中的α-SMA,collagen-I以及TIMP-1的蛋白水平,抑制了细胞增殖、促进细胞的凋亡。Western blot结果表明FOXO1的过度表达抑制TGF-β信号通路蛋白的表达,抑制了该通路的激活。结论:胆道梗阻所致的纤维化肝脏中存在差异性表达的miRNAs,并且miR-183-5p可能是调节肝纤维化的关键因子,miR-183-5p通过抑制FOXO1的表达,激活TGF-β信号通路,从而促进了胆汁淤积性肝纤维化。综上所述,抑制miR-183-5p可能是预防和改善肝纤维化的新方法。
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