背景与目的鼻咽癌(NPC)是一种具有鲜明的地域和种族性分布的头颈部肿瘤,具有独特的生物学特性：大多数为未分化型非角化性癌,早期转移至颈部淋巴结。更重要的是,患者放化疗后容易出现复发和远处转移,这往往是导致患者死亡的主要原因。80年代初期,姚开泰就首次提出鼻咽癌发病的“三次打击”假说,即EB病毒(EBV)、化学致癌物和胚性击中(即遗传因素或自发/诱发突变)构成NPC的主要病因。近年来,学者们对鼻咽癌发生发展的分子机制亦作了大量的研究。然而,鼻咽癌恶性侵袭和转移的分子机制十分复杂。如何能早期对鼻咽癌患者的侵袭和转移潜能进行准确评估,从而指导临床进行及时、有效的治疗,提高鼻咽癌患者的生存率、改善其预后,这是广大医疗和科研工作者当务之急。癌干细胞(CSCs)目前是肿瘤研究中的热点之一。CSCs理论认为肿瘤组织内有一小群细胞具有与干细胞类似的特性,即具有自我更新和多向分化的生物学特性,是恶性肿瘤患者出现局部复发和远处转移以及放化疗耐受的根源所在。近年来,学者们已通过表面分子标志物筛选成功分离和鉴定乳腺癌、结肠癌和肺癌等多种实体恶性肿瘤。2007年,姚开泰等最先提出和证实了鼻咽癌组织中存在CSCs细胞。最近,我们首次证实ALDH1(乙醛脱氢酶1)可作为分离和鉴定鼻咽癌CSCs的一种可靠的分子标记物。有兴趣的是,愈来愈多的研究表明,CSCs’‘干性”与EMT(上皮细胞-间充质细胞转化)的发生有着密切的联系。广为人知,EMT在恶性肿瘤的扩散和转移中起着重要的作用,其促使肿瘤细胞更容易从原发灶脱离,从而往周边间质进行侵袭和扩散。在鼻咽癌组织病检切片中,我们观察到,侵袭边缘或者浸润周边组织中的肿瘤细胞常常呈梭形间充质细胞形态。我们前期研究发现,这些梭形细胞中ALDH1的表达水平明显上调,提示其具有CSCs’‘干性”特性。早在1960年,我国著名的病理学家梁伯强就发现,这些具有高度侵袭能力的梭形细胞容易侵犯患者的颅底神经。然而,有关这种梭形癌细胞的恶性生物学行为以及相关分子特征,至今为止,人们知之甚少。因此,本课题的主要研究目的是：①检测这些梭形癌细胞与EMT发生之间的关系；②检测EMT相关蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况,分析其表达与鼻咽癌的侵袭性生物学行为的关系,评估其对患者预后的影响；③进一步,我们拟通过表达谱芯片实验筛选出鼻咽癌组织中EMT相关基因,为深入了解鼻咽癌侵袭和转移恶性进程中的具体分子机制及其生物学功能奠定坚实的实验基础。方法1.通过免疫组化方法在115例鼻咽癌组织梭形癌细胞和47例鳞状癌细胞中检测Pan-cytokeratin(全角蛋白)、E-cadherin(E-钙粘素)、N-cadherin(巢蛋白)、β-catenin、vimentin(波形蛋白)、fibronectin(纤维粘连蛋白)、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog等蛋白的表达情况；在此基础上,我们拟进一步检测梭形癌细胞的比例与鼻咽癌恶性生物学行为及预后的关系。2.通过免疫组化和组织荧光方法检测肿瘤出芽和ALDH1在105例鼻咽癌组织中的表达情况。1.构建包含122例鼻咽癌组织和29例慢性鼻咽炎组织在内的组织芯片(TMA)；2.通过免疫组化方法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、vimentin和Snail, CSCs相关蛋白ALDH1、SOX2、OCT4、Nanog和Nestin等蛋白在122例鼻咽癌的表达情况,分析它们的表达与临床病理特征和患者预后之间的联系;组织免疫荧光确证某些EMT或CSCs相关蛋白的定位表达。3.上述EMT和CSCs相关标志物蛋白在122例鼻咽癌组织中进行聚类分析。1.筛选出25例鼻咽癌活检组织及8例鼻咽正常上皮组织作为芯片实验对象,采用北京博奥22KHuman Genome Array人表达谱基因芯片进行芯片检测；2.SAM软件分析差异表达基因,qRT-PCR进行鉴定。在此基础上,通过在线网站进行文献挖掘,筛选出鼻咽癌中与EMT相关基因,并对其进行GO功能分析、KEGG通路和层次聚类等分析。结果1.与鳞状癌细胞比较,Pan-cytokeratin在梭形癌细胞中的表达差异无统计学意义(P=0.644)。相反,膜E-cadherin在梭形癌细胞中的表达明显下调,而β-catenin、N-cadherin、vimentin、fibronectin、Snail、Slug、ALDH1、SOX2、OCT4和Nanog蛋白在梭形癌细胞中的表达明显上调,两组间的差异均具有统计学意义(P<0.001)。此外,在梭形癌细胞中,膜E-cadherin表达与浆β-catenin(P<0.001)、vimentin (P<0.001), fibronectin (P<0.001)、Slug (P<0.001)、ALDH1(P<0.001)OCT4(P<0.001)和Nanog(P<0.001)表达呈显著负相关,但与N-cadherin (P=0.086)、Snail (P=0.093)和SOX2(P=0.0875)之间的表达无明显相关。有兴趣的是,我们进一步发现,梭形癌细胞含量与鼻咽癌T分期(P=0.036)、N分期(P=0.031)、临床分期(P=0.037)、淋巴管浸润(P=0.025)以及生存预后(P=0.004)有密切关系。2.在105例鼻咽癌组织中,肿瘤细胞低出芽组和高出芽组分别为53例(50.5%)和52例(49.5%)。肿瘤出芽(tumor budding)与肿瘤T分期(P=0.008)、淋巴管浸润(P<0.001)、血管浸润(P=0.029)、颈部淋巴结转移(P<0.001)以及临床分期(P-0.010)有着密切关联。单因素分析表明,肿瘤出芽高组中患者总体生存率明显低于低出芽组(P=0.002)。Cox多因素回归分析表明,肿瘤出芽是影响患者生存预后的一个独立因素(P=0.001)。并且,肿瘤出芽ALDH1表达与肿瘤T分期(P=0.034)、淋巴管浸润(P=0.002)、血管浸润(P=0.017)、颈部淋巴结转移(P=0.035)、临床分期(P<0.001)以及总体生存期(P<0.001)有着密切关联。1. E-cadherin胞膜和胞浆表达均与淋巴结转移(分别P<0.001和0.005)以及临床分期(分别P<0.001和0.007)有关联。β-catenin胞浆表达与T分期(P=0.020),淋巴结转移(P<0.001)和临床分期(P=0.036)有关,而β-catenin胞膜表达与患者的临床病理参数均无关联(P≥0.05)。Vimentin胞核表达与淋巴结转移(P<0.001)以及临床分期进展(P<0.001)密切相关。多因素生存分析表明,vimentin核表达(P=0.016)以及E-cadherin胞浆表达(P=0.001)是影响患者生存预后的独立指标。胞核vimentin/胞浆E-cadherin共表达与淋巴结转移(P<0.001)以及临床分期进展(P<0.001)密切有关。更重要的是,胞核vimentin/胞浆E-cadherin共表达组中患者生存时间明显缩短(P<0.001)。2.在122例鼻咽癌组织中,42.6%为N-cadherin胞浆高表达,45.1%为胞核高表达。N-cadherin胞浆和胞核表达与患者临床病理参数如淋巴结转移,远处转移和临床分期(P=0.012)均显著有关。N-cadheri胞浆和胞核之间表达水平呈正相关(P<0.001)。然而,N-cadherin胞浆或胞核表达与E-cadherin之间表达无相关性(P≥0.05)。单因素分析显示,N-cadherin胞浆表达高低对患者生存时间差异影响无统计学意义(P≥0.05)。然而,N-cadherin核高表达组中患者总体生存率明显低于核表达低组(P=0.002)。此外,在鼻咽癌临床晚期(Ⅲ-Ⅳ)患者中,N-cadherin核高表达组中的总体生存时间明显低于表达低组(P=0.033),但对Ⅰ-Ⅱ期患者总体生存期影响无统计学意义。Cox模型分析表明,N-cadherin胞核表达可作为一个独立的预后指标(P-0.024)。3.122例鼻咽癌组织中,46例(37.7%)为Snail胞浆表达,60例(49.2%)为Snail胞核表达。除了淋巴结转移(P=0.042),Snail胞浆表达与其它临床病理参数之间不存在明显关联。相反,Snail胞核表达与T分期(P=0.045),N分期(P=0.019),M分期(P=0.046)及临床分期进展(P=0.003)均有显著关联。此外Snail胞核表达与E-cadherin胞膜表达呈负相关(P=0.021)。单因素生存分析表明,鼻咽癌患者Snail胞核表达高组,而不是胞浆高表达组,其总体生存期明显低于低表达组(P<0.001)。多因素生存分析表明,Snail核表达可以独立影响鼻咽癌患者的生存预后(P<0.001),尤其是处于临床Ⅲ-Ⅳ期患者。4.我们的结果显示,SOX2,OCT4和Nanog蛋白在鼻咽癌组织中表达增高,并且在肿瘤组织侵袭边缘尤为常见,与EMT相关蛋白(E-cadherin/N-cadherin和Snail)显著相关。Nestin在鼻咽癌组织中甚少表达,然而,其在肿瘤组织侵袭边缘的血管内皮细胞中表达明显增高。侵袭边缘SOX2,OCT4或Nanog表达高组,患者总体生存率明显低于各低表达组(分别P=0.006,0.001和0.000)。多因素生存分析表明,OCT4和Nanog表达是影响患者预后的有价值的独立指标(分别P=0.006和0.001)。并且,肿瘤侵袭边缘OCT4/Nanog共表达组,患者总体生存率明显低于其它组别(P=0.005)。此外,有兴趣的是,在鼻咽癌组织的侵袭边缘,SOX2,OCT4和Nanog与CSCs标记物ALDH1以及血管内皮表达的Nestin蛋白呈显著正相关(P<0.001)。5.鼻咽癌组织中侵袭边缘ALDH1的表达与患者T分期(P=0.001), M分期(P<0.001),临床分期(P<0.001)以及淋巴管浸润(P<0.001)有关,组间差异明显有统计学意义。在鼻咽癌组织的侵袭边缘,ALDH1的表达水平与EMT相关蛋白如E-cadherin胞浆表达(P=0.001),vimentin胞核表达(P<0.001)以及Snail(P<0.001)存在显著正相关。单因素分析显示,患者肿瘤侵袭边缘ALDH1高表达组,其总体生存率明显降低。然而,多因素生存分析表明,侵袭边缘ALDH1表达不是影响患者预后的独立因素。侵袭边缘ALDH1表达对早期鼻咽癌患者(T1-T2,N0-N1)的总体生存率有着重要影响(分别P<0.001,P=0.002)。6.上述EMT和CSCs相关蛋白将122例鼻咽癌组织聚类成两大组(Group A和Group B)。与Group A相比,Group B中膜E-cadherin表达明显减少,而浆E-cadherin、vimentir、N-cadherin、SnaikOCT4和Nanog等表达明显上调。而且,我们结果发现,Group B与患者T分期、N分期、M分期、临床分期的进展以及梭形癌细胞的比例(≥20%)有着密切联系。更重要的是,Group B鼻咽癌患者的总体生存率明显低于Group A组。1.与鼻咽正常上皮组织比较,鼻咽癌组织中共有509个差异表达基因,其中表达上调基因306个,表达下调基因203个,这些差异基因主要参与细胞信号转导,细胞粘附,蛋白酶水解,细胞周期,细胞生长和凋亡等。2.通过专业文献挖掘软件,我们筛选与EMT密切相关的50个差异表达基因,GO功能分析表明,这些基因主要与转录调节,细胞粘附,细胞信号传导,蛋白酶水解,趋化作用及器官形成等有关。KEGG通路分析软件表明,这些鼻咽癌EMT相关基因主要涉及到Wnt信号通路,p53信号通路和MAPK信号通路等。并且,这些差异表达基因与鼻咽癌的临床病理特征如T分期、N分期、M分期和临床分期密切关联。结论1.鼻咽癌组织中的梭形癌细胞具有EMT和CSCs特性,其含量与鼻咽癌侵袭和转移进程密切相关；鼻咽癌组织中侵袭边缘存在肿瘤出芽现象,细胞具有CSCs特性；我们提出,前者是转移,而后者是早期侵袭的形态学风险标志。2.EMT相关蛋白如vimentin、N-cadherin和Snail, CSCs(?)目关蛋白如Nanog及OCT4在鼻咽癌组织中异常表达,可作为新的预测患者转移和不良预后风险因子。3.用22K人表达谱基因芯片在鼻咽癌组织中筛选出50个与EMT密切相关的差异表达基因,它们主要参与Wnt通路,p53通路及MAPK通路等信号传导；这些EMT相关基因可对鼻咽癌恶性进展进行分子分型。