花生细胞悬浮培养物中白藜芦醇的积累调控与分离纯化

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花生(Peanut)是一种重要的经济作物。在我国种植区域广阔,除西藏、青海、宁夏少数省区外,它在华北平原、渤海湾沿岸、华南沿海及四川盆地等都有种植华南沿海及四川盆地等都被广泛种植。花生中所含的白藜芦醇(Resveratrol略写为Res),是具有多种药理作用和生物活性化合物,具有抗菌抗炎、抗氧化、预防心脏病、抗癌、抗血小板凝聚、保护肝脏、免疫调节、防辐射、雌激素作用、抗艾滋活性等,被誉为21世纪最有前途的抗癌药物之一,具有重要的研究和开发价值。目前市售的白藜芦醇及其制品,主要来源于从如虎杖、葡萄等植物中提取。本文以花生植株为试验材料,较为系统地研究了花生植株的生物技术和次生代谢产物Res的提取、分离纯化工艺:进行愈伤组织诱导培养、摇瓶悬浮培养;建立花生细胞摇瓶悬浮培养的结构化动力学模型;研究诱导子对花生细胞生长和白藜芦醇积累的影响;进行花生细胞生物反应器悬浮培养的初步扩大试验;通过二次通用旋转组合试验设计优化大孔树脂纯化花生根中白藜芦醇的最佳工艺条件。主要研究结果如下:1.在愈伤组织诱导培养中,培养基种类、外植体类型和激素配比对愈伤组织诱导及白藜芦醇含量有显著影响。通过三元二次通用旋转试验确定愈伤组织诱导培养的最佳激素配比,从而得到最适培养基是:MS+2.50 mg/L 2,4-D+1.80 mg/L KT+3.00 mg/L6-BA。高产白藜芦醇花生细胞系生物量最大达到43.95 g/L,白藜芦醇产量最大达到9.07 mg/g。2.悬浮培养过程中研究了摇床转速、接种量、pH和蔗糖浓度对悬浮细胞增殖倍数的影响。通过四元二次通用旋转试验确定悬浮培养的优化条件为:摇床转速130 r/min,接种量38.00 g/L,pH5.80,蔗糖浓度40.00 g/L。测定了培养过程中细胞组织的蛋白质含量、苯丙氨酸转氨酶活性、过氧化物酶活性,它们的变化都在一定程度上反映了悬浮细胞生长及白藜芦醇含量变化情况。3.在对花生根细胞悬浮培养过程进行系统的动力学试验的基础上,以培养基中蔗糖在培养过程中所经历的途径为依据,建立了结构化动力学模型,并采用该结构模型描述花生根细胞的生长、Res的合成积累以及与培养基底物消耗的动态变化关系。为了能清晰地描述花生细胞悬浮培养的各反应过程,建立了生物相与非生物相各组分基于质量平衡方程的反应速率表达式。根据物料平衡原理,培养体系中任一组分j的生成速率为:整个模型为一组非线性微分方程,通过试验测定和分析、文献查阅和计算机求解等多途径确定动力学模型参数。模型计算与试验结果基本相符,表明该结构化动力学模型能较好地描述花生根细胞悬浮培养过程,可以对培养过程中的某些现象给出合理的解释。4.研究了水杨酸(SA)和乙烯利对花生根细胞生物量及白藜芦醇产量的影响。结果表明:SA对花生根细胞生物量没有明显的促进作用,过量的SA能引起细胞褐化;而低浓度的乙烯利(<5 mg/L)对细胞的生长有一定的促进作用。SA和乙烯利均能促进白藜芦醇总产量的提高。5.00mg/L SA处理9d略微促进白藜芦醇的生产(增产8.00mg/L);而5 mg/L乙烯利处理9d能显著提高白藜芦醇的总产量(增产96.00 mg/L)。5.在摇瓶悬浮培养的基础上,采用2L气升式生物反应器进行花生细胞悬浮培养初步放大试验,跟踪检测培养过程中的Res的积累、基质消耗、pH值变化等生理生化指标并与摇瓶培养箱比较,结果发现,花生细胞生物反应器悬浮培养的糖基消耗、pH值变化等趋势与摇瓶培养基本相似。6.通过大孔吸附树脂型号优选试验、DA-201树脂吸附白藜芦醇的动力学试验、DA-201树脂等温吸附试验、上样量试验与动态洗脱试验以及以考察上样流速、洗脱流速和洗脱溶剂浓度的三元二次通用旋转组合设计柱层析试验等研究发现:DA-201树脂等温吸附白藜芦醇过程符合Langmuir和Freundilch方程,该过程为吸热物理吸附过程;由此进一步分析讨论确定在上样浓度为0.70mg/mL,上样液的pH=3,上样体积为20.0mL,洗脱体积为15.0mL条件下,进行DA-201大孔吸附树脂柱层析纯化试验,可以得到大孔吸附树脂柱层析纯化白藜芦醇的数学模型:Y=75.516-4.79X1-549X2+8.914X3-1.612X1X2-2.542X12-2.498X22-8.107X32经过回归分析以及方差分析,对方程进行局部寻优得出:在上样流速1.0mL/min,洗脱流速1.6 mL/min,乙醇浓度76%,其纯化后白藜芦醇的得率为80.43±0.13%,经HPLC检测其纯度可以达到39.61%。
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