论文部分内容阅读
铁是机体生长必需的一种微量元素，在生猪养殖过程中，通常需要给仔猪补铁避免缺铁症状。但是在仔猪感染时若继续补铁则能够加重感染，对畜牧生产造成不必要的损失。早期研究发现，动物受到病原菌感染后，细菌与宿主细胞在利用铁方面存在竞争关系，在此过程中，宿主细胞会通过分泌乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)、转铁蛋白、血红素等以应对细菌的入侵，其中乳铁蛋白不仅能够螯合铁，而且还能够抑制细菌的生长。因此本试验聚焦猪乳铁蛋白(Porcine lactoferrin，pLF)，探究其铁螯合功能在大肠杆菌K88感染过程中的作用。
试验一:细菌感染对机体LF体内表达水平的影响
本试验首先探讨了正常情况下新生仔猪体内pLF的表达情况。结果显示，新生仔猪血清中pLF浓度能够达到500μg/mL，在出生后10天迅速降低至100μg/mL(P＜0.05)，并隧日龄的增长有逐渐减少的趋势，这可能是母猪乳汁中pLF随着日龄增长而减少导致;比较20日龄仔猪体内各组织pLF表达水平发现，pLF主要表达在十二指肠、空肠、回肠、脾脏、肾脏，在脾脏和肾脏表达最高，而在肝脏、结肠和肠系膜淋巴结中表达较少，其中脾脏pLF表达量可以达到肝脏组织中的8倍以上。以上结果表明，pLF存在组织表达规律，这可能与pLF的功能有关。
随后本试验研究了野生型C57BL/6J小鼠体内的LF表达水平。结果显示，小鼠体内LF主要在骨髓、脾脏、十二指肠、空肠、回肠、结肠、肌肉中表达，骨髓、脾脏、空肠中表达量最高，而在肝脏、肾脏、脑中表达量较少，其中骨髓中的LF的表达量可以达到肝脏的20000倍，脾脏中LF的表达量也能达到肝脏的3000倍以上。以上结果表明，LF在小鼠和仔猪脾脏、十二指肠、空肠、回肠均有较高水平的表达，提示LF的组织表达规律在这二者之间存在一定的相似性。
于是本试验以大肠杆菌E.coli K88感染后的小鼠为模型，探讨细菌感染对体内LF表达水平的影响。结果显示，E.coli K88感染后小鼠血清中LF浓度升高了两倍(P＜0.05)，最高可达35μg/mL;比较感染前后各组织LF水平可发现，肝脏、十二指肠、结肠、肾脏、回肠的LF的表达量均显著上升（P＜0.05），其中肝脏中LF表达量升高最为明显，升高倍数可以达到感染前的50多倍;肠道免疫组化结果显示，E.coli K88感染后十二指肠、结肠绒毛固有层内LF含量显著升高，其中十二指肠最为明显。以上结果表明，E.coli K88感染能够显著提高小鼠机体内多种组织以及血清中LF的表达，提示其可能参与细菌的感染过程与机体的免疫过程。
LF螯合铁之后需要经受体介导进入宿主细胞，因此本试验也探讨了小鼠肠道乳铁蛋白受体(Lactoferrin receptor，LFR)在E.coli K88感染前后表达水平的差异。结果显示，正常情况下LFR在空肠和回肠表达量较高，在结肠表达量最低，其中空肠和回肠LFR表达量均为十二指肠的两倍以上(P＜0.01);E.coli K88感染后，LFR基因表达水平在十二指肠、空肠、回肠和结肠均显著升高(P＜0.05)，其中结肠LFR表达量比正常情况下升高了6倍以上;肠道免疫组化结果显示，十二指肠、空肠、回肠和结肠隐窝处LFR表达在感染后均显著升高。以上结果提示肠道LFR也可能参与了细菌的感染过程和机体的免疫过程。
随后在蛋白和基因水平综合比较了LF和LFR在肠道的表达差异发现，小鼠染菌后十二指肠和结肠的LF及LFR表达均最为明显，回肠次之，空肠内LF表达量反而显著下降，提示LF和LFR应对细菌入侵的反应可能主要发生在十二指肠和结肠。
十二指肠是动物肠道中吸收铁的主要部位，比较E.coli K88感染前后十二指肠普鲁士蓝染色和免疫组化结果发现，小鼠染菌后十二指肠内铁水平显著升高，十二指肠肠吸收细胞LF和LFR表达含量均显著升高。以上结果提示在感染状态下，十二指肠通过LF和LFR可以吸收更多的铁。
以上结果表明:E.coli K88感染能够导致小鼠体内多种组织以及血清中LF表达增加，其中在肠道LF和LFR可能均参与了细菌的感染过程，其发挥作用的部位主要是十二指肠和结肠，十二指肠内铁水平、LF和LFR含量的增加提示LF可能通过螯合铁发挥它的抑菌作用。
试验二:乳铁蛋白对细胞和细菌生长的影响
根据试验一的结果，发现LF能够参与E.coli K88的感染过程。本试验通过外源添加pLF，探究了pLF对猪肠道上皮细胞IPEC-J2抗感染作用和小鼠巨噬细胞RAW264.7迁移作用的影响。细胞增殖试验结果显示，添加pLF能够显著促进IPEC-J2细胞的增殖。抗感染试验结果显示，pLF处理能够降低感染细胞的细菌总量，并显著降低黏附和入侵细胞的细菌总量(P＜0.01)，提示其能够提高IPEC-J2细胞的抗感染能力。在炎症反应方面，pLF显著抑制了E.coli K88激活的TLR4/NF-κB信号基因的表达，降低了E.coli K88感染IPEC-J2细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达(P＜0.05)，提示pLF通过抑制NF-κB炎症信号通路及下游炎症因子的表达来缓解E.coli K88感染肠道细胞的炎症反应。巨噬细胞迁移试验结果显示，pLF作用能够显著促进巨噬细胞的迁移(P＜0.01)。以上结果证明pLF在E.coli K88感染过程中能够发挥抗感染的功能。
进一步地，本试验通过制备不同铁饱和程度的pLF，探究了pLF铁饱和程度对细菌生长的影响。抑菌试验结果显示，铁饱和程度为22.58％的天然pLF和铁饱和程度为6.9％的apo-pLF均能够显著抑制大肠杆菌K88(P＜0.01)和金黄色葡萄球菌Sa的生长(P＜0.05)，但不能抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，而铁饱和程度100％的holo-pLF则不能抑制任何细菌的生长，提示pLF的抑菌功能与自身铁饱和程度相关。补铁试验结果显示，在apo-pLF产生抑菌效果后补充铁可以促进细菌的增长，进一步证明了pLF抑菌功能与其铁饱和程度相关。限铁试验结果显示，使用低铁培养基能够限制E.coli K88和Sa的生长，但对鼠伤寒沙门氏菌效果不明显，说明鼠伤寒沙门氏菌生存对铁的依赖程度较低。电镜试验结果显示，apo-LF作用后E.coli K88和Sa菌体表面均出现了不同程度的突起或破损，胞内物质渗出，提示apo-LF能够作用于细菌表面，诱导细菌死亡。三维结构预测显示，apo-pLF和holo-pLF三维结构开放程度明显不同，提示apo-LF可能存在直接杀菌位点。以上结果提示，pLF能够通过螯合铁来抑制E.coli K88和Sa的生长，并且apo-pLF也存在一定的杀菌能力，这可能与其自身的结构相关。
综上所述，本研究表明，LF和LFR能够参与大肠杆菌K88感染导致的小鼠肠道炎症反应，其主要作用部位可能是十二指肠和结肠。此外，pLF能够增强IPEC-J2细胞的抗感染能力，通过抑制NF-κB炎症信号通路来缓解炎症反应，并且能够促进巨噬细胞的迁移。最后，pLF能够通过螯合铁来发挥其抑菌功能，从而抵抗大肠杆菌K88的感染。
试验一:细菌感染对机体LF体内表达水平的影响
本试验首先探讨了正常情况下新生仔猪体内pLF的表达情况。结果显示，新生仔猪血清中pLF浓度能够达到500μg/mL，在出生后10天迅速降低至100μg/mL(P＜0.05)，并隧日龄的增长有逐渐减少的趋势，这可能是母猪乳汁中pLF随着日龄增长而减少导致;比较20日龄仔猪体内各组织pLF表达水平发现，pLF主要表达在十二指肠、空肠、回肠、脾脏、肾脏，在脾脏和肾脏表达最高，而在肝脏、结肠和肠系膜淋巴结中表达较少，其中脾脏pLF表达量可以达到肝脏组织中的8倍以上。以上结果表明，pLF存在组织表达规律，这可能与pLF的功能有关。
随后本试验研究了野生型C57BL/6J小鼠体内的LF表达水平。结果显示，小鼠体内LF主要在骨髓、脾脏、十二指肠、空肠、回肠、结肠、肌肉中表达，骨髓、脾脏、空肠中表达量最高，而在肝脏、肾脏、脑中表达量较少，其中骨髓中的LF的表达量可以达到肝脏的20000倍，脾脏中LF的表达量也能达到肝脏的3000倍以上。以上结果表明，LF在小鼠和仔猪脾脏、十二指肠、空肠、回肠均有较高水平的表达，提示LF的组织表达规律在这二者之间存在一定的相似性。
于是本试验以大肠杆菌E.coli K88感染后的小鼠为模型，探讨细菌感染对体内LF表达水平的影响。结果显示，E.coli K88感染后小鼠血清中LF浓度升高了两倍(P＜0.05)，最高可达35μg/mL;比较感染前后各组织LF水平可发现，肝脏、十二指肠、结肠、肾脏、回肠的LF的表达量均显著上升（P＜0.05），其中肝脏中LF表达量升高最为明显，升高倍数可以达到感染前的50多倍;肠道免疫组化结果显示，E.coli K88感染后十二指肠、结肠绒毛固有层内LF含量显著升高，其中十二指肠最为明显。以上结果表明，E.coli K88感染能够显著提高小鼠机体内多种组织以及血清中LF的表达，提示其可能参与细菌的感染过程与机体的免疫过程。
LF螯合铁之后需要经受体介导进入宿主细胞，因此本试验也探讨了小鼠肠道乳铁蛋白受体(Lactoferrin receptor，LFR)在E.coli K88感染前后表达水平的差异。结果显示，正常情况下LFR在空肠和回肠表达量较高，在结肠表达量最低，其中空肠和回肠LFR表达量均为十二指肠的两倍以上(P＜0.01);E.coli K88感染后，LFR基因表达水平在十二指肠、空肠、回肠和结肠均显著升高(P＜0.05)，其中结肠LFR表达量比正常情况下升高了6倍以上;肠道免疫组化结果显示，十二指肠、空肠、回肠和结肠隐窝处LFR表达在感染后均显著升高。以上结果提示肠道LFR也可能参与了细菌的感染过程和机体的免疫过程。
随后在蛋白和基因水平综合比较了LF和LFR在肠道的表达差异发现，小鼠染菌后十二指肠和结肠的LF及LFR表达均最为明显，回肠次之，空肠内LF表达量反而显著下降，提示LF和LFR应对细菌入侵的反应可能主要发生在十二指肠和结肠。
十二指肠是动物肠道中吸收铁的主要部位，比较E.coli K88感染前后十二指肠普鲁士蓝染色和免疫组化结果发现，小鼠染菌后十二指肠内铁水平显著升高，十二指肠肠吸收细胞LF和LFR表达含量均显著升高。以上结果提示在感染状态下，十二指肠通过LF和LFR可以吸收更多的铁。
以上结果表明:E.coli K88感染能够导致小鼠体内多种组织以及血清中LF表达增加，其中在肠道LF和LFR可能均参与了细菌的感染过程，其发挥作用的部位主要是十二指肠和结肠，十二指肠内铁水平、LF和LFR含量的增加提示LF可能通过螯合铁发挥它的抑菌作用。
试验二:乳铁蛋白对细胞和细菌生长的影响
根据试验一的结果，发现LF能够参与E.coli K88的感染过程。本试验通过外源添加pLF，探究了pLF对猪肠道上皮细胞IPEC-J2抗感染作用和小鼠巨噬细胞RAW264.7迁移作用的影响。细胞增殖试验结果显示，添加pLF能够显著促进IPEC-J2细胞的增殖。抗感染试验结果显示，pLF处理能够降低感染细胞的细菌总量，并显著降低黏附和入侵细胞的细菌总量(P＜0.01)，提示其能够提高IPEC-J2细胞的抗感染能力。在炎症反应方面，pLF显著抑制了E.coli K88激活的TLR4/NF-κB信号基因的表达，降低了E.coli K88感染IPEC-J2细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达(P＜0.05)，提示pLF通过抑制NF-κB炎症信号通路及下游炎症因子的表达来缓解E.coli K88感染肠道细胞的炎症反应。巨噬细胞迁移试验结果显示，pLF作用能够显著促进巨噬细胞的迁移(P＜0.01)。以上结果证明pLF在E.coli K88感染过程中能够发挥抗感染的功能。
进一步地，本试验通过制备不同铁饱和程度的pLF，探究了pLF铁饱和程度对细菌生长的影响。抑菌试验结果显示，铁饱和程度为22.58％的天然pLF和铁饱和程度为6.9％的apo-pLF均能够显著抑制大肠杆菌K88(P＜0.01)和金黄色葡萄球菌Sa的生长(P＜0.05)，但不能抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，而铁饱和程度100％的holo-pLF则不能抑制任何细菌的生长，提示pLF的抑菌功能与自身铁饱和程度相关。补铁试验结果显示，在apo-pLF产生抑菌效果后补充铁可以促进细菌的增长，进一步证明了pLF抑菌功能与其铁饱和程度相关。限铁试验结果显示，使用低铁培养基能够限制E.coli K88和Sa的生长，但对鼠伤寒沙门氏菌效果不明显，说明鼠伤寒沙门氏菌生存对铁的依赖程度较低。电镜试验结果显示，apo-LF作用后E.coli K88和Sa菌体表面均出现了不同程度的突起或破损，胞内物质渗出，提示apo-LF能够作用于细菌表面，诱导细菌死亡。三维结构预测显示，apo-pLF和holo-pLF三维结构开放程度明显不同，提示apo-LF可能存在直接杀菌位点。以上结果提示，pLF能够通过螯合铁来抑制E.coli K88和Sa的生长，并且apo-pLF也存在一定的杀菌能力，这可能与其自身的结构相关。
综上所述，本研究表明，LF和LFR能够参与大肠杆菌K88感染导致的小鼠肠道炎症反应，其主要作用部位可能是十二指肠和结肠。此外，pLF能够增强IPEC-J2细胞的抗感染能力，通过抑制NF-κB炎症信号通路来缓解炎症反应，并且能够促进巨噬细胞的迁移。最后，pLF能够通过螯合铁来发挥其抑菌功能，从而抵抗大肠杆菌K88的感染。