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研究背景及目的:2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(Tempo)是小分子氮氧自由基,带有一个单电子,既具有还原性又具有氧化性。它有细胞穿透作用、低毒、无致癌及致突变作用。在低浓度时,表现抗氧化性;在浓度>lmM时,表现促氧化性。本文主要基于Tempo表现促氧化性进行研究。水飞蓟宾(Silybin)是黄酮类化合物,因分子结构中含有共轭双键和醇基,所以它既能发生氧化反应又能发生还原反应。临床上Silybin主要用于慢性肝炎、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病等作用,Silybin在抗肿瘤中也有重要作用。顺铂是卵巢癌主要化疗药物之一,但其临床应用的副作用不可忽视,因此提高顺铂的疗效并降低副作用是值得探讨的课题。肿瘤细胞能量代谢以糖酵解为主,这是肿瘤的特征之一。细胞内nNOS催化L-精氨酸胍基末端上的氮基团发生氧化,生成NO。有研究指出,NO是卵巢癌糖酵解的正调控因素之一,课题组前期实验也证明nNOS促进卵巢癌糖酵解。因此我们想要探讨Tempo及Silybin会否通过干扰nNOS产生NO的过程,影响nNOS促进糖酵解的功能,从而增强卵巢癌顺铂敏感性。实验结果:第一节 Tempo促进顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡MTT实验结果表明Tempo抑制卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞的增殖及Tempo促进顺铂对OVCAR3细胞增殖的抑制作用。细胞凋亡实验证明Tempo促进顺铂诱导的OVCAR3细胞凋亡;Western Blot实验结果显示Tempo降低顺铂诱导的OVCAR3细胞内Bcl-2/Bax的表达;ROS探针标记实验结果表明Tempo促进顺铂诱导的OVCAR3细胞凋亡通过增加细胞内ROS水平;此部分实验共同表明Tempo促进顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡,即Tempo增强卵巢癌细胞的顺铂敏感性。第二节 Tempo通过干扰nNOS功能抑制卵巢癌细胞的糖酵解硝酸根/亚硝酸根荧光检测实验及Western Blot实验结果表明Tempo抑制卵巢癌细胞的nNOS产生NO及抑制nNOS蛋白表达;葡萄糖消耗和乳酸生成实验,ATP生成和NADPH生成实验共同表明Tempo抑制卵巢癌细胞的糖酵解。课题组前期实验证明nNOS通过促进糖酵解关键酶PFK1和PKM2的亚硝化,进而促进卵巢癌糖酵解作用。亚硝化实验结果显示Tempo抑制PFK1和PKM2的亚硝化,由此提示,Tempo通过抑制nNOS产生NO,影响NO亚硝化修饰PFK1和PKM2,进而抑制PFK1和PKM2的亚硝化。第三节Silybin通过干扰HSP90与nNOS的结合抑制nNOS促糖酵解功能通过MTT实验结果表明Silybin增强顺铂对卵巢癌细胞增殖的抑制作用。硝酸根/亚硝酸根荧光检测实验及Western Blot实验结果表明Silybin抑制卵巢癌细胞nNOS的功能和蛋白表达。葡萄糖消耗和乳酸生成实验结果表明Sliybin抑制卵巢癌细胞的糖酵解。免疫共沉淀实验结果表明HSP90与nNOS结合,Silybin抑制HSP90与nNOS结合从而抑制nNOS功能。