单精子胞质内显微注射(ICSI)技术能够提高配子利用率，获取所需性别动物，解决雄性动物少精不孕问题，作为辅助技术在转基因工程研究领域具有重大作用。在实施ICSI操作过程中，通常在操作液中添加PVP(聚乙烯吡咯烷酮——一种高分子物质)来降低精子运动性，减少注射针与精子的粘连，便于操作。但是，PVP同精子一起注入到胞质内会包围在精子周围，不但使精子质膜变得坚韧影响破裂，影响精核解聚，而且阻碍精子向胞质释放使卵母细胞激活的精子蛋白，影响卵母细胞的活化，使ICSI的成功率受到严重影响；但是，不添加PVP由于粘连会明显增加显微操作难度。本试验针对ICSI技术存在的注射针粘连、卵膜柔韧程度、PVP物质包绕精子、精子解聚困难和卵母细胞活化不足等问题，通过研究ICSI操作液中防粘连物质的使用和选择可以替代PVP的新的生理性防粘连物质，减少PVP所产生的不良影响，探索克服和解决这些ICSI技术问题的方法，提高猪ICSI效果。本试验目的是研究作为PVP替代物质的HA(透明质酸)，配合在操作液中使用CB(细胞松驰素B)，进行猪ICSI操作的基本程序，通过减少传统的在操作液中使用PVP存在的不良作用，提高猪ICSI胚胎发育率。试验首先通过传统的方法，在操作液中添加PVP进行ICSI操作，研究精子解聚和原核形成的时间；进而研究ICSI后卵母细胞的电、化学激活方法；操作液中添加CB的辅助作用；在固定电、化学激活参数和原核观察时间的基础上，试验选择和PVP有类似润滑作用的生理性物质HA，分别对PVP和HA的适宜操作浓度进行了研究；最后以卵裂率、8-细胞以上胚胎发育率为指标比较在最适PVP和HA浓度下两种防粘连物质对猪ICSI效果的影响。研究结果如下：试验一：猪ICSI后精子解聚和原核形成时间观察。采用猪精子进行ICSI，分别于注射后7h、10h、13h、16h和19h通过荧光染色观察精核解聚和原核形成情况。ICSI后7小时仅有5.2％的精子解聚，并未见到雌雄原核的形成。ICSI后10h，12.5％精子进入解聚状态；ICSI后13h，处于精核解聚状态的精子所占比率增至29.0％，有6.5％精子已经形成雄原核；ICSI后16h，16.7％精子处于解聚状态，雄原核形成率迅速增至28.8％；ICSI后19h，12.5％精子处于解聚状态，41.7％精子形成雄原核。结果表明精核解聚主要发生在ICSI后13h-16h，雄原核形成率随着时间延长而增。这为后面试验观察解聚精子和原核形成提供了时间依据，观察精核解聚和原核形成的时间为ICSI后16h为宜。试验二：不同激活方法对猪ICSI效果的影响。在本试验中，针对卵母细胞ICSI后活化不足的问题，在ICSI后进行一般性电激活(场强0.4KV/cm、脉冲时程90μs、一次脉冲)的基础上，之后分为三组，对照组在电激活清洗后直接放胚胎液中培养；其他两组分别在电激活后用2mmol/L 6—DMAP、10ug/ml CHX处理6h，进行化学补充激活，清洗后放入胚胎液中培养。结果表明，对照组卵裂率低于6—DMAP组和CHX组，与6—DMAP组差异极显著(41.0％vs 44.3％)(p＜0.01)，与CHX组差异显著(41.0％vs 43.5％)(p＜0.05)。对照组8-细胞以上胚胎数低于6—DMAP组和CHX组，与6—DMAP组差异极显著(14.1％vs 19.0％)(p＜0.01)，与CHX组差异显著(14.1％vs 17.6％)(p＜0.05)。6—DMAP组和CHX组之间卵裂率和8-细胞以上胚胎数无显著差异(p＞0.05)。上述结果说明：猪体外成熟卵母细胞ICSI后仅依靠电激活不足以使MⅡ期中期的卵母细胞活化，采用电激活+6—DMAP(或CHX)激活，能够有效活化卵母细胞，降低MPF分子作用，从而提高ICSI胚胎的发育效果，后面试验均采用6—DMAP进行化学补充激活。试验三：操作液中添加CB对ICSI效果的影响。本试验针对注射精子时卵膜的脆弱易损问题，比较在操作液中添加CB与对照组(不添加CB)的试验效果。试验组卵裂率高于未加CB组的对照组(46.7％vs 43.7％)，差异显著(p＜0.05)，试验组8-细胞以上胚胎数高于对照组(18.7％vs 18.3％)，差异不显著(p＞0.05)，说明注射卵母细胞的操作液中添加CB不但能够使操作容易进行，而且还可以改善猪ICSI受精卵的卵裂效果。试验四：操作液中添加不同浓度PVP对ICSI效果的影响。试验选择5％和10％两组PVP浓度进行试验，结果表明两组解聚精子数无显著差异(16.5％vs 16.8％)(p＞0.05)，5％PVP组雄原核形成数高于10％PVP组(28.7％vs 23.7％)，差异显著(p＜0.05)，5％PVP组卵裂率高于10％PVP组，差异显著(46.7％vs 42.2％)(p＜0.05)，5％PVP组8-细胞以上胚胎数略高于10％PVP组，差异不显著(18.7％vs 17.6％)(p＞0.05)。结果说明降低PVP浓度有利于雄原核形成，能够提高猪ICSI卵的卵裂率。试验五：操作液中添加不同浓度HA对ICSI效果的影响。试验选择在操作液中添加0.5mg/ml、1.5mg/ml和2.5mg/ml三组HA浓度进行试验，结果表明三组解聚精子数(16.0％vs15.7％，16.2％)和雄原核形成数(30.2％vs 30.4％，29.3％)无显著差异(p＞0.05)。0.5mg/ml HA组卵裂率低于其他两组，差异极显著(46.0％vs50.1％，49.6％)(p＜0.01)，1.5mg/ml HA组与2.5mg/ml HA组卵裂率(50.1％vs 49.6％)和8-细胞以上胚胎数(22.4％vs 21.2％)差异不显著(p＞0.05)，0.5mg/ml HA组8-细胞以上胚胎数最低。操作液中添加1.5mg/ml HA更有利于注射卵的发育。1.5mg/ml HA组和5％PVP组相比较，操作过程中润滑作用相似，两组解聚精子比率之间无显著差异(p＞0.05)；HA组雄原核形成率、卵裂率、8-细胞以上胚胎数都显著高于PVP组(30.4％vs 28.7％)(50.1％vs 46.7％)(22.4％vs 18.75％)(p＜0.05)。结果表明，操作液中用1.5mg/ml HA代替5％PVP更有利于注射卵的发育。结论：猪ICSI操作过程中，操作液中添加CB，并且用1.5mg/ml HA代替5％PVP，电激活后再用6—DMAP处理6h对卵母细胞进行化学补充激活能够明显改善猪ICSI胚胎的发育效果。与传统的在猪ICSI操作液中添加PVP的方法相比，从精子解聚、原核形成、卵裂率、8-细胞以上胚胎数等多方面统计结果可以看出，所选择的HA不但能够像PVP一样增加润滑程度、减少精子对注射针的粘附，而且还使精、卵之间的互作加强，猪ICSI效果明显提高。