毛兰素通过调控血管稳态改善肝脏脂质累积和血—视网膜屏障损伤的研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:MENTAL2010
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从中医基础理论角度来看,糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)属于中医“消渴”病的范畴,现代药理学研究发现DM并发症大都伴随血管病变的发生。其中非酒精性脂肪肝(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是糖尿病常见的并发症之一,肝脏血管稳态在其发生发展中是否具有参与作用目前尚不明确。而糖尿病视网膜病(Diabetic Retinopathy,DR)则是DM最常见且最严重的微血管并发症之一。毛兰素(Erianin)作为鼓槌石斛的药典指标性成分,实验室的前期研究显示其可显著抑制非增殖性糖尿病视网膜病(Nonproliferative Diabetic Retinopathy,NPDR)时期视网膜内炎性损伤及增殖性糖尿病视网膜病(Proliferative Diabetic Retinopathy,PDR)时期视网膜内新生血管形成,提示其对血管稳态具有潜在调控活性,但毛兰素能否通过调控血管稳态改善NAFLD病变肝脏脂质累积及NPDR血-视网膜屏障(Blood-Retinal Barrier,BRB)损伤尚不清楚。本研究旨在从维持血管稳态的角度探讨NAFLD的发病机制,并在此基础上研究毛兰素对NAFLD的改善作用;同时从调控炎性-视网膜微血管稳态缓解BRB破损的角度探讨毛兰素改善DR早期病变的机制。本研究结果发现db/db、GK及高脂饮食(High fat diet,HFD)诱导的NAFLD大鼠肝脏脂质累积显著升高,链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠肝脏脂质含量显著下调。对肝脏脂质合成、转运、代谢相关关键酶基因表达分析初步提示不同动物模型肝脏脂质含量差异与其无相关性。进一步设计实验探讨血管稳态改变,结果显示db/db、GK及HFD大鼠肝脏脂质累积的增加伴随肝脏血管内皮间质转化(Endothelial-Mesenchymal Transition,Endo MT)的发生,反之STZ诱导Ⅰ型糖尿病小鼠肝脏脂质含量下降伴随出现肝窦毛细血管化,差异主要体现在血管内皮细胞钙粘连蛋白(VE-cadherin)、血小板-内皮细胞粘附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1/CD31)表达变化的不同。进一步运用VE-Cadherin中和抗体,结果显示VE-Cadherin中和抗体可显著增加小鼠脂质转运入肝。对不同模型血清血管内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factorα,TNFα)及白介素6(Interleukin-6,IL6)的分析结果显示此三种细胞因子随造模变化趋势一致,即不同模型肝脏血管VE-Cadherin表达差异不由VEGFA、TNFα、IL6介导。后续设计实验检测不同模型血清胰岛素(Insulin)水平,结果显示insulin含量增加伴随肝脏血管VE-Cadherin表达下调,Insulin含量减少伴随VE-Cadherin表达上调,即呈现负相关。进一步体外细胞实验结果显示insulin刺激24 h可诱导血管内皮细胞发生Endo MT表型转化,下调其跨内皮电阻,升高游离脂肪酸(Nonesterified Fatty Acid,NEFA)渗漏水平。核转录因子E2相因子2(Nuclear Factor Erthroid 2-Related Factor 2,Nrf2)被报道对VE-Cadherin具有潜在调控作用。体外细胞实验结果显示insulin可下调Nrf2核转位,体内动物实验结果发现db/db、GK、HFD模型动物肝脏血管部位Nrf2核转位显著下调,而Ⅰ型糖尿病造模导致动物肝脏血管部位Nrf2核转位的上升,结合VE-Cadherin表达结果可得:动物肝脏血管部位Nrf2核转位激活水平同VE-Cadherin表达变化正相关。染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay,CHIP)实验结果显示Nrf2可通过结合VE-Cadherin启动子区域直接调控其表达。进一步运用Nrf2敲除(Nrf2 Knockout,Nrf2 KO)动物结果显示:野生型(Wild Type,WT)小鼠Ⅰ型糖尿病造模诱导肝脏脂质水平下调及VE-Cadherin表达升高,而Nrf2敲除逆转了上述变化,证明Nrf2介导了Ⅰ型糖尿病动物肝脏血管VE-Cadherin表达上调及后续脂质含量的下降。进一步设计实验从三方面探讨Insulin调控Nrf2机制。首先基因水平分析结果显示除db/db动物外,其余动物模型肝脏Nrf2基因表达水平同其蛋白水平一致,提示insulin可能通过调控Nrf2基因表达影响其核转位。其次设计实验检测insulin对Nrf2上游蛋白表达影响,结果显示insulin亦可通过胰岛素受体(Insulin Receptor,IR)下调p62/SQSTM1(p62)表达,从而减少Nrf2的核转位激活。进一步对Nrf2乙酰化水平的分析结果显示:同种模型肝脏血管Nrf2乙酰化及同p300结合能力变化同其核转位变化一致。对转录因子GATA结合蛋白4(GATA Binding Protein 4,GATA4)的核转位及乙酰化水平分析结果发现:同种模型动物肝脏血管部位GATA4的乙酰化、其同p300结合能力及核转位水平变化与Nrf2变化完全相反。进一步对db/db小鼠、HFD大鼠的分析结果显示造模诱导肝脏血管部位p300同Nrf2结合能力的下降以及与GATA4结合能力的上升;Nrf2 KO动物结果显示WT小鼠Ⅰ型糖尿病造模诱导动物肝脏血管部位p300同Nrf2结合能力的上调及与GATA4结合能力的下调,同时伴随GATA4乙酰化水平及核转位激活的下调,而Nrf2敲除逆转上述变化。以上实验共同说明:GATA4与Nrf2可竞争性结合p300;Insulin可通过介导GATA4竞争性结合p300,抑制p300与Nrf2的结合,减少Nrf2乙酰化,从而调控其核转位激活。基于上述机制研究展开毛兰素药效活性评价。GK、db/db动物实验结果显示毛兰素可抑制造模诱导动物肝脏脂质水平上升。体外L-02细胞实验结果发现毛兰素对NEFA诱导L-02细胞中脂质含量增加无影响。进一步设计体内外实验分析其活性机制,结果显示毛兰素可通过上调肝脏内皮细胞p62表达、抑制GATA4核转位从而促进Nrf2核转位激活,改善肝脏内皮细胞稳态变化,逆转insulin介导的内皮细胞VE-Cadherin表达下调、跨内皮电阻下调及NEFA渗漏增加,最终发挥抑制肝脏脂质累积的活性。视网膜血管稳态在维持DR病变BRB平衡中具有重要作用。本研究动物实验结果显示:毛兰素可逆转非增殖性糖尿病视网膜病(Nonproliferative Diabetic Retinopathy,NPDR)中BRB紧密连接(Tight Junction,TJ)的受损以及渗漏增加。NPDR视网膜血管损伤多为炎性反应介导,接下去从调控炎性损伤角度探讨毛兰素改善NPDR的机制。体内外结果显示毛兰素可以通过抑制神经小胶质细胞内葡萄糖转运蛋白1(Glucose Transporter Type 1,GLUT1)-胞外调节MAP激酶1/2(Extracellular Regulated MAP Kinase 1/2,ERK1/2)-核因子кB(Nuclear Factor Kappa B,NFкB)-TNFα信号轴减少NPDR病变中炎性介导的BRB破损,毛兰素还可直接抑制损伤介质TNFα导致的BRB损伤。简而言之,本论文研究发现:1.VE-Cadherin介导肝脏血管稳态调控肝脏脂质转运,Insulin-IR-p62/GATA4-Nrf2信号轴在肝脏血管稳态调控中发挥重要作用;毛兰素可通过逆转Ⅱ型糖尿病造模诱导肝脏血管稳态变化抑制肝脏脂质累积。2.毛兰素可结合GLUT1抑制胶质细胞葡萄糖摄取、抑制ERK1/2-NFκB-TNFα信号通路激活,缓解TNFα介导视网膜血管稳态改变,发挥改善NPDR药效活性。
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