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一、研究背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤,发病率逐年增加。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是HCC发生的最主要危险因素之一。HBV整合是HBV相关性HCC（HBV-HCC）发生发展的重要驱动因素。其主要通过表达病毒蛋白、顺式激活作用、产生新的融合转录本以及诱发基因组不稳定而介导HCC发生发展。和非HBV所致的HCC相比,HBV-HCC患者具有诊断年龄较低、肝硬化发生率低的特点。早发性HBV-HCC患者往往有大量HBV整合事件发生,且预后不良,在这一人群中HBV整合有直接临床意义。近年发展起来的第三代测序技术在重复序列检测、结构变异检测等方面有独特优势,增强了我们对于人类基因变异的全谱学理解,正在彻底改变研究人员对于基因组的研究。应用第三代测序技术对早发性HBVHCC中HBV整合的描绘将为探索HBV整合特点、促癌机制提供新视角。二、研究目的基于三代测序平台描绘早发性HBV-HCC患者中HBV整合特点;探讨HBV整合作为原发性肝细胞癌的主要驱动因素在HBV-HCC发生发展中的作用及机制;为HCC的早诊早治提供线索。三、研究方法第一部分:收集16对早发肝癌患者（年龄＜=35岁）的肿瘤组织和癌旁组织标本及病理资料,随机抽取其中6对标本进行全基因组重测序,测序使用Nanopore测序平台,产生的数据使用NANOQC软件进行质控分析,用Porechop软件获取和删除接头,用Minimap2软件进行数据比对,用Nanofilt软件对数据进行过滤,用Nanostate软件对读序（Reads）质量和长度进行统计。进而进行结构变异分析、差异基因注释等生物信息学分析;提取HBV-人嵌合Reads,分别再次与HBV和人基因组比对,进行统计分析,并用PCR扩增、一代测序验证。第二部分:用基因组步移结合一代测序技术得到HBx-SINE全长序列。全基因合成HBx-SINE、PVT1启动子、c-Myc启动子,构建报告基因质粒:HBx-SINE-p GL3-Promoter、c-Myc-p GL3-Basic、HBx-SINE-p GL3-Basic、HBx-SINE-c-Myc-p GL3-Basic、PVT1-p GL3-Basic、HBx-SINE-PVT1-p GL3-Basic,转染人胚肾细胞株HEK293T、人结肠癌细胞株HCT116、HT29和人肝癌细胞株Hep G2、Hu H7、LM3、MHCC-97H,利用报告基因系统检测并分析HBx-SINE在不同细胞中对SV40病毒启动子、c-Myc启动子、PVT1启动子转录调控的影响。并对HBx-SINE进行截短突变,构建HBx-SINE截短突变报告基因质粒:HBx-SINE（1-519 bp）-p GL3-Promoter、HBx-SINE（520-1,258 bp）-p GL3-Promoter、HBx-SINE（364-690 bp）-p GL3-Promoter、HBx-SINE（907-1,258 bp）-p GL3-Promoter、HBxSINE（796-1,116 bp）-p GL3-Promoter;HBx-SINE（1-519）-c-Myc-p GL3-Basic、HBxSINE（520-1,258）-c-Myc-p GL3-Basic、HBx-SINE（364-690）-c-Myc-p GL3-Basic、HBxSINE（907-1,258）-c-Myc-p GL3-Basic、HBx-SINE（796-1,116）-c-Myc-p GL3-Basic,经转染肝癌细胞后,使用报告基因系统,分析HBx-SINE对SV40病毒启动子和c-Myc启动子转录调控活性影响的核心区域。第三部分:用生物素标记HBx-SINE核心区域,构建生物素标记探针,利用DNApull down结合LC-MS/MS方法检测并分析与HBx-SINE核心区域结合的蛋白,并用凝胶迁移实验、Ch IP-q PCR验证特异性结合蛋白。进而,使用CRISPR-Cas9系统构建PARP1敲除细胞系及敲除空载对照细胞系如下:Hu H7-PARP1-KO、Hu H7-KO-Control、Hep G2-PARP1-KO、Hep G2-KO-Control,用在第二部分中构建的p GL3系列报告基因质粒转染上述细胞,以验证在Hu H7和Hep G2细胞内PARP1是否为HBx-SINE对SV40病毒启动子和c-Myc启动子转录调控活性影响的关键分子。第四部分:用RT-q PCR检测HBV相关的肝癌细胞系中PARP1和c-Myc的表达量,并分析两者是否存在共表达关系。利用CRISPR-Cas9系统构建PARP1敲除细胞系和敲除对照细胞系:PLC\PRF\5-PARP1-KO、PLC\PRF\5-KO-Control;Hep G2.2.15-PARP1-KO、Hep G2.2.15-KO-Control。利用CRISPR-d Cas9系统构建PARP1激活细胞系和激活对照细胞系:PLC\PRF\5-PARP1-Activation、PLC\PRF\5-Activation-Control;Hep G2.2.15-PARP1-Activation、Hep G2.2.15-Activation-Control。收集上述细胞蛋白,进行蛋白免疫印迹实验,以证实在HBV-HCC细胞中PARP1和c-Myc的表达相关性。利用上述构建的细胞系进行CCK8、克隆形成和Edu掺入实验,检测PARP1在HBV-HCC细胞系中的功能。四、结果第一部分:（1）早发HBV-HCC患者肿瘤组织中整合的HBV序列长度可以从数十碱基到超过三千碱基,HBV基因组序列的1600-2000 bp区域整合频率较高。（2）肿瘤组织中HBV整合呈克隆性,而癌旁组织中的HBV整合多为散发性。（3）肿瘤组织中HBV在1号染色体中整合频率最高。（4）HBV整合与人染色体CNV存在关联。（5）HBV整合在人不同染色体间融合中起桥接作用。第二部分:（1）测序验证得到HBx-SINE全长序列。（2）HBx-SINE在肝癌细胞系Hep G2、Hu H7、LM3、MHCC-97H中对SV40病毒启动子的转录调控活性有显著增强作用,而在人胚肾细胞株HEK293T、人结肠癌细胞株HCT116、HT29并无此作用。（3）HBx-SINE（518-906 bp）区域是HBx-SINE对SV40病毒启动子转录调控活性增强的核心区域。（4）HBx-SINE在肝癌细胞中对c-Myc启动子的转录调控有增强作用,且HBxSINE（518-906 bp）区域也是HBx-SINE对c-Myc启动子转录调控活性增强作用的核心区域。（5）HBx-SINE在肝癌细胞中对PVT1启动子转录调控活性无明显作用。第三部分:（1）PARP1是HBx-SINE结合的主要蛋白分子。（2）PARP1蛋白特异性结合HBx-SINE核心区域。（3）PARP1是影响HBx-SINE细胞内转录调控活性的关键分子。第四部分:（1）HBV-HCC细胞系中PARP1和c-Myc表达正相关。（2）SNU-387、SNU-182、Hep G2.2.15和Hep3B细胞中HBV病毒均存在8号染色体整合,且整合涉及多条染色体多个基因;PLC\PRF\5细胞系HBV整合位点数少。（3）HBV整合细胞中PARP1和c-Myc存在共表达关系。（4）PARP1和c-Myc两者间存在相互作用。（5）PARP1分子是调控HBV相关肝癌细胞增殖的关键分子。五、结论在早发性HBV-HCC患者肿瘤组织中HBV整合呈克隆性,提示HBV整合优势克隆扩增为HBV-HCC的早期驱动事件。HBV-HCC患者肿瘤组织中HBV在不同染色体间融合起桥接作用,且高频发生,可能促进HBV-HCC的早期发生。HBV整合与基因组拷贝数变异存在关联。肿瘤组织中,人染色体HBV高频整合8q24区整合序列HBx-SINE通过结合PARP1增强c-Myc启动子在HBV-HCC细胞中的转录调控活性而导致肿瘤组织中c-Myc高表达促进HBV-HCC早期发生。