目的:在宫颈癌Si Ha和He La细胞中使用CRISPR/Cas9建立TET1基因敲降的稳转细胞株,研究TET1基因对宫颈癌细胞生物学行为的影响及相关作用机制。方法:利用CRISPR/Cas9技术,针对TET1基因,设计两对sg RNA:Oligo-TET1-F1/R1和Oligo-TET1-F2/R2,通过Bsm BI酶对载体质粒进行酶切,将两对sg RNA退火后连接到CRISPRv2载体上,再把连接产物转化入感受态细胞DH5α中,挑取单个克隆菌落扩大培养并送检测序,根据测序结果,挑取比对正确的Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒及CRISPRv2质粒经慢病毒包装转染宫颈癌细胞,分别作为TET1敲降实验组和空载体组,未经任何处理的宫颈癌细胞作为野生型组。提取各组宫颈癌细胞的基因组DNA,使用T7E1酶切法验证TET1的敲降结果,进一步提取宫颈癌细胞蛋白,采用Western blot检测TET1蛋白的表达情况。常规培养细胞期间,观察细胞形态是否发生改变;采用划痕实验、transwell侵袭实验检测野生型组、空载体组、TET1敲降组宫颈癌细胞迁移及侵袭能力;使用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)及MTT增殖实验检测不同组别宫颈癌细胞的增殖能力;利用克隆形成实验检测不同组别宫颈癌细胞的克隆形成能力;利用流式细胞术检测不同组别宫颈癌细胞的细胞周期;运用Western blot检测不同组别宫颈癌细胞E6蛋白、p53蛋白、自噬相关分子指标及上皮间质转化相关分子指标的表达情况。结果:1)重组质粒送检测序结果显示使用第二对Oligo-TET1-F2/R2引物成功的构建了表达Cas9及sg RNA的慢病毒载体,T7E1酶切验证及Western blot结果提示TET1被成功敲降。2)TET1敲降后宫颈癌Si Ha和He La细胞细胞形态发生明显的改变,细胞变长,细胞出现较多伪足样改变;对TET1敲降的细胞进行相应实验检测,发现TET1敲降后,促进了细胞的迁移、侵袭、增殖及克隆形成能力,使G0/G1期细胞显著减少,而S期和G2/M期,即DNA合成期和DNA合成后期显著增加,加快了细胞周期进程,加速了细胞的增长。3)Western blot检测结果显示在Si Ha细胞中敲降TET1后,能促进E6蛋白的表达,抑制p53蛋白的表达。4)Western blot检测结果还提示在Si Ha细胞中敲降TET1后影响细胞自噬,并促进宫颈癌细胞的上皮间质转化(EMT)。结论:1)利用CRISPR/Cas9技术成功的构建TET1敲降稳转细胞株;2)TET1具有调节宫颈癌细胞生物学行为的能力;3)TET1会影响宫颈癌细胞E6蛋白及p53蛋白的表达能力;4)TET1可能具有调节宫颈癌细胞的上皮间质转化(EMT)及影响细胞自噬的能力。