论文部分内容阅读
目的：
本研究旨在利用视频跟踪一计算机自动分析的条件位置偏爱(conditioned place preference，CPP)实验系统，进一步证实Glu-Con G抗吗啡精神依赖的药效，确定其有效剂量范围，为进一步设计、筛选防治吗啡依赖的芋螺毒素类似物提供理论依据；应用免疫印迹方法(Western blotting)检测吗啡成瘾小鼠纹状体脑区SFKs的Tyr416位点磷酸化(pSFKs(Tyr416))水平的变化，探讨SFKs在吗啡成瘾中的作用机制，同时观察Glu-Con G是否通过干预这些成瘾相关脑区SFKs的异常活化而发挥干预作用。
材料和方法：
1实验动物
清洁级雄性昆明种小鼠，体重18～20 g，每笼4只，自由摄取食物和水。在本校实验动物中心屏障系统中适养2周后开始实验。
2主要药物和试剂
盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂，批号：041101)；生理盐水(浙江平湖莎普爱思制药有限公司，批号：040711)；[Glu3,4,7,10,14]-Conantokin G(Sigma，产品号：C1733，纯度>9096)。Phospho-Src Family(Tyr416)-抗(Cell Signaling Technology)；Src-抗(Cell Signaling Technology)；Actin-抗(Santa Cruz Biotechnology)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(北京中杉生物有限公司)。
3 CPP实验装置
视频跟踪一计算机自动分析CPPS主要由隔音箱、小鼠活动盒、摄像系统和计算机组成。隔音箱顶部装有摄像头，通过视频线连接到一个装有视频采集卡的计算机，能同步观察小鼠的活动情况并摄像保存。小鼠活动盒为4个相同的长方形PVC材料穿梭盒(30×15×15cm)组成一个45×45×15cm的正方形盒子，每个穿梭盒被一个隔板分成两个大小相同的正方形盒子(15×15×15cm)，其中一个盒子四周均为白色，底面光滑，做为伴药盒；另一个四周均为黑色，底面镂刻成网格。摄像系统可以完整记录小鼠的活动情况，采集的视频图像用改进后的Rat/Mice Tracking软件进行分析。实验时背景噪音<30 dB，活动盒底部平均照度<20 Lux。
4 CPP训练程序
包括天然偏爱测试、CPP的建立和表达三个阶段，具体操作步骤如下：
天然偏爱测试：实验开始前三天(d-2、d-1、d0)，穿梭盒中间采用通道型隔板，将小鼠放置两盒交界处，让其在两盒内自由活动15分钟，摄录活动情况，分析其天然偏爱情况。根据天然偏爱情况将所有小鼠随机分为9组，包括生理盐水对照组(NS、NS-NS)，吗啡对照组(Mor、M-GO)，Glu-Con G单独给药组(NS-G120、NS-G240)及Glu-Con G干预组(M-G15、M-G30、M-G60、M-G120、M-G240)。
条件化训练：选择白盒作为伴药盒，进行条件化训练。训练阶段采用封闭型隔板将穿梭盒分隔成两个独立的盒子，实验组小鼠在d1、d3、d5、d7腹腔注射吗啡(5 mg/kg)后放置白盒训练50分钟；d2、d4、d6、d8腹腔注射生理盐水(0.5 ml/kg)后放置黑盒训练50分钟。对照组小鼠均腹腔注射生理盐水，其它处理同实验组小鼠。
CPP表达测试：在实验d9，将中间隔板换成通道型，小鼠未作任何处理放置两盒交界处，让其在两盒内自由活动15分钟，摄录其活动情况，用Rat/MiceTracking软件分析小鼠在黑盒和白盒内的停留时间、运动距离、穿梭次数等指标，作为位置偏爱、运动活性以及探索行为的评价指标。
5 芋螺毒素给药处理
芋螺毒素类似物Glu-Con G以生理盐水做溶剂。在吗啡诱导CPP表达测试(d9)前30min，吗啡合并芋螺毒素给药组小鼠右侧脑室分别给予15、30、60、120、240 pmol Glu-Con G，单独给药组小鼠分别给予120、240 pmol Glu-Con G，对照组小鼠给予生理盐水，给药容量均为2μl/只。
6 Western blotting：
根据行为学实验结果，分离NS-NS、NS-G240、M-G0、M-G30、M-G60、M-G120和M-G240组小鼠的DS和NAc脑区并检测pSFKs(Tyr416)和总SFKs蛋白的含量。
总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。灌制SDS-PAGE(10％的分离胶和5％的积层胶)，将配成相同蛋白浓度并处理好的蛋白样品上样(每孔30μg)，电泳(100V，2h)，用湿电转膜法将蛋白转至硝酸纤维膜(200 mA，2h)。取出膜放入含5％牛血清白蛋白(BSA)的TBST液，室温轻摇2h，取出膜，放入Phospho-Src Family(Tyr416)一抗液(1：2000稀释)，4℃孵育过夜。次日，TBST液快速摇洗后(30 min)，将膜放入HRP标记的羊抗兔二抗液(1：6000稀释)，室温下孵育1小时，TBST液快速摇洗后(30 min)，置等体积ECL A液和ECL B液混合的发光剂底物液中1 min，曝光15 min左右，显影、定影。将膜放入自制抗原抗体洗脱液，50℃洗脱15 min，TBST快速洗膜15 min，再将膜放入含有Src一抗和Actin一抗的稀释液(均为1：4000稀释)中，室温孵育2小时；用TBST快速洗膜30 min，将膜放入HRP标记的羊抗兔二抗液(1：6000稀释)中，温和振荡1小时；用TBST决速洗膜30 min；再次置于等体积ECL A液和ECL B液混合的发光剂底物液中1 min，曝光15 min左右，显影、定影。
7 实验观察指标及统计分析
摄录的视频文件用Rat/Mice Tracking软件分析位置偏爱指标：白盒停留时间；运动活性指标：总运动距离、穿梭次数；探索行为指标：总中心停留时间、总中心徘徊距离与总运动距离的比值、白盒中心停留时间与白盒停留时间的比值以及白盒中心徘徊距离与白盒徘徊距离的比值。
Western blotting实验结果光密度测定：胶片用光密度扫描仪(GS-800型)扫描入计算机，用Bio-Rad Quantity One(R)图像分析软件计算每张胶片中各条带的平均灰度，pSFKs(Tyr416)和SFKs蛋白分别以每张胶片中相应条带SFKs蛋白和内参Actin蛋白的灰度做标准计算相应比值，同一胶片中各组蛋白条带的灰度值以生理盐水对照组pSFKs(Tyr416)和SFKs蛋白条带的相对灰度值进行标化，以百分数表示其含量的高低，进行半定量分析。
用SPSS统计软件对以上数据进行统计分析，均用均数士标准误表示，P<0.05视为有统计学差异。
结论：
1.改进、完善的视频跟踪-计算机自动分析CPP系统能同时分析大/小鼠位置偏爱指标、运动活性指标及探索行为指标，可以为全面评价药物在干预吗啡精神依赖方面的药效提供更多实验数据和有价值的线索；
2.单次脑室内给予Glu-Con G可呈剂量-效应依赖性方式干预吗啡成瘾小鼠CPP的表达，相比于Con G(60 pmol，0.003 mg/kg)，Glu-Con G的最小有效剂量(30 pmol，0.0015 mg/kg)更低；同时未见小鼠运动活性及探索行为的异常，提示其在防治吗啡成瘾方面可能具有更大的潜力和更广阔的临床应用前景；
3.长期吗啡处理可以引起成瘾小鼠DS和NAc脑区SFKs的异常活化，提示SFKs参与吗啡成瘾记忆的形成；单次脑室内给予不同浓度Glu-Con G可能通过阻断吗啡诱导NMDAR兴奋后产生的Ca2+内流从而间接抑制SFKs的异常活化，提示SFKs涉及的信号环路参与Glu-Con G对吗啡奖赏效应的干预作用，但单一SFKs活化程度或者含量的改变并不足以完全解释动物的行为学变化。