继发性乳糖不耐受婴儿的肠道菌群及乳糖酵解代谢研究

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目的:通过测定继发性乳糖不耐受婴儿粪便中的乳糖含量,肠道菌群构成以及乳糖代谢产物成分如乳酸和短链脂肪酸(short-chainfattyacid,SCFA)的变化,探究0-1岁继发性乳糖不耐受婴儿肠道菌群特征及乳糖代谢的特征,为乳糖在肠道的代谢提供有价值的参考指标,对继发性乳糖不耐受婴儿提供合理干预。资料与方法:选取2021年3月至2021年11月期间至苏州大学附属儿童医院消化科门诊及住院部就诊的31例1岁以内存在腹泻、肠绞痛、腹胀症状的继发性乳糖不耐受婴儿,设为病例组,平均年龄为4.70(3.20,8.76)个月,男女比例为11:20,其中母乳喂养或母乳喂养为主27例,配方奶或配方奶喂养为主4例;同时选取28例1岁以内苏州市某社区例行体检的健康婴儿,设为对照组,平均年龄为5.50(3.77,8.00)个月,男女比例为14:14,其中母乳喂养或母乳喂养为主20例,配方奶或配方奶喂养为主8例。收集研究对象的新鲜粪便标本于无菌、干燥、可密封的塑料容器中,于2小时内制成10%的粪便混悬液,分成四份:第一份用于测定粪便pH值,取4-5g新鲜粪便,加入中性蒸馏水15-20ml,充分振荡摇匀后,用pH计测定其pH值;第二份用于测定粪便的乳糖含量,向标本中分别加入纯净水(A管)、乳糖酶(B管)后置于37℃培养箱中孵育20分钟,使用生化分析仪分别检测A、B管的葡萄糖含量,计算出B管与A管之间的差值,所得数值即为加入乳糖酶水解后产生的净糖含量,可代表婴儿粪便中乳糖含量;第三份取4-5g新鲜标本放于保存液中,充分摇匀,用于完善16S rRNA基因测序;第四份将粪便混悬液依次接种于基础培养基(YCFA)、乳果糖培养基(LAU)、乳糖培养基(LAT)、低聚半乳糖培养基(GOS)、低聚果糖培养基(FOS)、可溶性淀粉培养基(STA)、菊粉培养基(INU)、水解乳清蛋白培养基(YLP)、水解酪蛋白培养基(YCP)中,在37℃培养箱中静置发酵24小时后,用气体测压仪逐个测定培养基中的产气量,采用气相色谱法(Gas chromatography,GC)测定各个培养基中的短链脂肪酸SCFA即总酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的含量,用自动生化仪检测乳酸含量,最后将实验所得数据汇总至Microsoft Excel表中,运用SPSS26.0对数据进行分析。结果:1.肠道菌群:1.1两组间α多样性无统计学意义(P>0.05),β多样性有统计学意义(P<0.05);1.2病例组中拟杆菌门、部分厚壁菌门(丹毒丝菌纲、毛螺菌科、瘤胃菌科、巨球菌属、小韦荣球菌)、红蝽菌纲、柯林斯氏菌属较对照组减少(P<0.05);而梭菌属、丁酸梭菌较对照组明显升高(P<0.05);1.3基因功能预测中,病例组中糖酵解功能明显低于对照组(P<0.05)。2.粪便中微生物代谢产物特点:2.1病例组婴儿的粪便残余乳糖含量为0.48 mmol/L,对照组为0.24 mmol/L,病例组明显高于对照组(P<0.05);2.2病例组婴儿的粪便pH值稍低于观察组,但两组间比较,差别无统计学意义(P>0.05);2.3粪便混悬液中,病例组中的L-乳酸、D-乳酸含量高于对照组(P<0.05);2.4病例组中总酸、乙酸、丙酸及异丁酸含量均明显低于对照组(P<0.05),丁酸含量两组间比较差别无统计学意义(P>0.05);病例组粪便中的乙酸:丙酸:丁酸占SCFA总酸的比值约为79.0:9.5:5.7;对照组三者占SCFA总酸的比值约为81.8:10.0:5.3。两组间比较,病例组中的乙酸、丙酸百分比低于对照组,丁酸百分比高于对照组,但两组间相比差异均无统计学意义(P>0.05);3.粪便微生物对寡糖的发酵作用:3.1病例组婴儿粪便在LAT培养基中L-乳酸含量高于对照组(P<0.05),与YCFA培养基结果相一致,病例组婴儿粪便在LAT培养基中D-乳酸含量高于对照组,但两组间比较差别无统计学意义;3.2粪便发酵后,病例组婴儿粪便在LAT培养基中总酸含量低于对照组(P<0.05),与 YCFA、LAU、FOS、GOS、INU、STA、YCP、YLP 培养基结果相一致;3.3粪便发酵后,病例组婴儿粪便在LAT培养基中乙酸含量低于对照组(P<0.05),与 YCFA、LAU、FOS、GOS、INU、STA、YCP、YLP 培养基结果相一致;3.4粪便发酵后,病例组婴儿粪便在LAT培养基中丙酸含量低于对照组(P<0.05),与 YCFA、LAU、FOS、GOS、INU、STA、YCP、YLP培养基结果相一致;3.5粪便发酵后,病例组婴儿粪便在LAT培养基中丁酸含量在两组间差别无统计学意义(P>0.05),在YCFA培养基中丁酸含量低于对照组(P<0.05);3.6粪便发酵后,病例组婴儿粪便在LAT培养基中异丁酸含量低于对照组(P<0.05),与 YCFA、LAU、FOS、GOS、INU、STA、YLP 培养基结果相一致,在YCP培养基中含量高于对照组(P<0.05);3.7病例组婴儿粪便在LAT培养基产气量明显高于对照组(P<0.05),与FOS、GOS、STA培养基中产气结果一致;在YCFA、LAU、INU、YCP、YLP培养基中差别均无统计学意义。结论:1.乳糖不耐受婴儿肠道菌群结构异常,能够进行糖酵解的菌群数量下降,导致糖酵解能力下降,SCFA含量降低;2.乳酸作为乳糖的中间代谢产物,在病例组中含量升高,表明在乳糖不耐受婴儿肠道中,能够利用中间代谢产物的菌群数量下降,菌群不能将乳糖完全转化为SCFA,中间代谢产物堆积;3.乳糖不耐受婴儿粪便发酵后产气量增加,提示乳糖不耐受婴儿的肠道菌群结构异常,产气菌较多;4.乳糖不耐受引起腹泻可能的机制是乳糖不耐受患儿乳糖酶缺乏,造成粪便乳糖含量升高,且肠道菌群结构紊乱,发酵乳糖能力下降,乳糖不能完全转化为SCFA,乳酸等中间代谢产物堆积,肠道渗透压升高,且SCFA减少导致水、Na+重吸收障碍等导致腹泻;5.本研究测定了继发性乳糖不耐受婴儿粪便残余乳糖含量,利用体外发酵模型测得产酸、产气含量,并用16s RNA基因测序测定肠道菌群变化情况,为继发性乳糖不耐受婴儿的乳糖酵解及肠道菌群情况提供了有价值的参考指标,从而对继发性乳糖不耐受婴儿提供合理干预。
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