【摘 要】
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猪丁型冠状病毒属冠状病毒科,丁型冠状病毒属的成员,基因组为单股正链RNA。PDCo V属于猪病毒性腹泻病原体之一,临床上可以导致各个阶段的猪只发病,尤其对新生仔猪最为敏感。PDCoV能够引起感染仔猪出现水样腹泻、呕吐、脱水和急性死亡,从而导致仔猪很高的发病率和死亡率。此外,PDCo V与PEDV、TGEV等猪病毒性腹泻病原体可导致相似的临床症状,且PDCo V与PEDV等其他病原体混合感染的情况很
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猪丁型冠状病毒属冠状病毒科,丁型冠状病毒属的成员,基因组为单股正链RNA。PDCo V属于猪病毒性腹泻病原体之一,临床上可以导致各个阶段的猪只发病,尤其对新生仔猪最为敏感。PDCoV能够引起感染仔猪出现水样腹泻、呕吐、脱水和急性死亡,从而导致仔猪很高的发病率和死亡率。此外,PDCo V与PEDV、TGEV等猪病毒性腹泻病原体可导致相似的临床症状,且PDCo V与PEDV等其他病原体混合感染的情况很常见,使得该病的防控和诊断难度大大增加。PDCo V首次于2012年在中国香港被发现并报道,随后于2014年在美国爆发流行,该病毒已经呈现全球流行的趋势,对全球生猪养殖业的发展造成严重威胁和对人类健康可能存在潜在影响。为了快速鉴别检测猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪急性腹泻综合症冠状病毒（SADS-Co V）四种猪病毒性腹泻病原体,本研究分别针对TGEV的S基因、PEDV的M基因、PDCo V的N基因和SADS-Co V的N基因设计了四对特异性引物,经过优化反应体系,建立了TGEV、PEDV、PDCo V和SADS-Co V多重降落RT-PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的多重降落RT-PCR检测方法仅特异性扩增TGEV、PEDV、PDCo V和SADS-Co V,四种病毒之间没有交叉反应,同时与猪的其他病毒也无交叉反应;该方法对TGEV、PEDV、PDCo V和SADS-Co V的检测限分别为8.54×10~4 copies/μL、6.48×10~5 copies/μL、7.79×10~4 copies/μL、5.66×10~3 copies/μL,具有较高的敏感性;另外,本研究利用经过普通RT-PCR鉴定为TGEV、PEDV、PDCo V和SADS-Co V阳性的共23临床样本进行该方法的临床检测效果评价,结果表明两种检测方法的符合率为100%。多重降落RT-PCR检测方法与普通RT-PCR检测方法的检测效果相当。本研究利用LLC-PK细胞系对RT-PCR检测为PDCo V阳性的猪小肠内容物进行病毒分离。通过细胞病变观察和多重降落RT-PCR检测,结果成功分离到一株能够在LLC-PK细胞系上稳定传代的猪丁型冠状病毒毒株（命名为CHN-HN-17）。通过蚀斑纯化实验,成功将CHN-HN-17毒株进行纯化。本研究分离毒株已经在LLC-PK细胞系中持续传代至第F90代,病毒滴度测定结果表明,随着传代次数的增加,CHN-HN-17毒株在LLC-PK细胞系上已经达到很好的适应状态,病毒滴度从102.53 TCID50/m L（F10）上升至108.23 TCID50/m L（F90）。本研究对CHN-HN-17毒株进行全基因组与NCBI中41株PDCoV参考序列进行分析。结果表明,CHN-HN-17毒株基因组中的ORF1ab基因、S基因、E基因、M基因和N基因存在碱基的插入、缺失或突变;序列同源性分析显示,CHN-HN-17毒株与41株参考毒株的全基因同源性为97.5%～99.0%;S基因的同源性为96.0%～98.6%;N基因的同源性为97.2%～99.7%。CHN-HN-17毒株与41株参考毒株的全基因遗传进化分析表明,CHN-HN-17毒株与泰国和越南毒株的亲缘关系较远,与CH/Sichuan/S27/2012毒株亲缘关系最近;基于S基因和N基因的遗传进化分析表明,CHN-HN-17毒株与CHN-HG-2017毒株亲缘关系最近,且与美国、日本和韩国毒株处于同一进化分支。综上所述,本研究建立了鉴别猪丁型冠状病毒的多重降落RT-PCR检测方法,同时对PDCoV CHN-HN-17毒株进行了分离鉴定和基因组分析。本研究对PDCoV的病原诊断,疫苗研制和疫病防控等方面具有重要的意义。
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