【摘 要】
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目的:观察丁酸钠对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的帕金森病细胞模型的保护作用及其对BDNF成熟体mBDNF和前体proBDNF表达的影响。方法:以0-200uM浓度的6-OHDA作用不同时间,诱导损伤PC12细胞,之后通过CCK-8法检测6-OHDA对PC12细胞的毒性作用,筛选细胞造模的最佳药物浓度及作用时间;光学显微镜下观察不同浓度和作用时间的6-OHD
【基金项目】
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国家自然科学基金（81760237）；
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目的:观察丁酸钠对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的帕金森病细胞模型的保护作用及其对BDNF成熟体mBDNF和前体proBDNF表达的影响。方法:以0-200uM浓度的6-OHDA作用不同时间,诱导损伤PC12细胞,之后通过CCK-8法检测6-OHDA对PC12细胞的毒性作用,筛选细胞造模的最佳药物浓度及作用时间;光学显微镜下观察不同浓度和作用时间的6-OHDA对细胞生长形态和数量的影响;使用HE染色法观察嗜酸性包涵体生成;细胞免疫荧光法观察α-synuclein在胞内聚集情况;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测正常PC12细胞及造模浓度药物作用PC12细胞12h、24h的胞内mBDNF表达变化。在建模成功的基础上,预先使用不同浓度丁酸钠（NaB）干预处理细胞1h后与6-OHDA共培养24h,再以CCK-8法检测加用丁酸钠预处理模式细胞的细胞存活率;运用实时荧光定量PCR检测丁酸钠对6-OHDA诱导PC12细胞BDNF、弗林蛋白酶（Furin）mRNA表达的情况。细胞免疫荧光观察PC12细胞中TH、BDNF的表达情况。Western blot测定丁酸钠对帕金森病细胞模型proBDNF、mBDNF的表达变化。结果:1、6-OHDA刺激PC12细胞后,呈剂量（50、100、150、200 uM）和时间依赖性的方式抑制细胞活性,降低细胞存活率。2、光学显微镜下观察PC12细胞随6-OHDA药物处理浓度的加大和作用时间的延长,生长抑制越强,且细胞形态由整体饱满,轮廓不规则,突触伸展,变成形态皱缩圆顿,突触变细变短甚至消失。3、HE染色发现PD细胞模型核周的胞浆部位出现聚集成块的圆形或椭圆形嗜伊红包涵体,甚至有包涵体游走于细胞外。4、细胞免疫荧光显示与对照组相比PD细胞模型胞浆内存在包涵体α-synuclein阳性反应物。5、Western blot测定结果显示,6-OHDA的诱导损伤,使PC12细胞内mBDNF表达呈现出时间依赖性降低的趋势。6、CCK8数据表明,丁酸钠能显著提高6-OHDA诱导损伤PC12细胞的存活率,在一定浓度范围内呈浓度依赖性效应。7、qPCR检测明确了模型组经6-OHDA处理后,BDNF和Furin mRNA相比正常组均减少,而NaB预处理之后BDNF mRNA明显升高,但仍然低于正常水平。NaB处理的实验组细胞Furin mRNA水平相比模型组增加,但差异不具统计学意义（P>0.05）。8、免疫荧光检测结果显示,TH和BDNF蛋白表达均集中在胞质,正常组、实验组、模型组表达蛋白的细胞数目依次减少。9、相比正常组细胞,模型组mBDNF蛋白表达明显降低,NaB处理后降低趋势减弱。而proBDNF蛋白在模型组较比正常组略微降低,NaB处理后较模型组无明显变化（P>0.05）。结论:6-OHDA诱导的PC12细胞PD模型内存在proBDNF/mBDNF失衡,proBDNF所占比例升高,且mBDNF的表达降低与6-OHDA的诱导呈时间依赖性。NaB可以从mRNA和蛋白质水平影响该模型细胞BDNF表达,降低PD模型细胞内升高的proBDNF/mBDNF蛋白比例,提高PD模型细胞的存活率,明确了其对6-OHDA诱导的PC12细胞帕金森病体外模型具有一定的保护作用。
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