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绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)是我国著名的传统中药,具有与人参类似的药理功效,但无寒凉燥热以及长期服用人参所致的头晕、心悸等副作用。因此,绞股蓝是一味药食同源的中草药,有着“人间仙草”的美誉。近年来随着世界各地对绞股蓝研究的日益深入,发现它的主要活性成分是皂苷、黄酮类和糖类。作为绞股蓝主要活性成分之一的绞股蓝皂苷(Gypenosides,GP),其具有抗病毒、抗氧化、免疫增强等效果,在病毒性肝炎的防治方面有着重要的作用。因此本研究选择GP作为候选治疗方案。为了提高或增加中药成分的生物学活性,分子修饰已成为近年来药物化学重要的研究领域,主要修饰方法包括磷酸化,硫酸化,乙酰化等。在这些方法中,磷酸化和硫酸化均能显著增强被修饰成分的生物活性;但磷酸化修饰比硫酸化更安全,方便和环保。因此,本试验采用磷酸化分子修饰的方法,通过正交试验得到绞股蓝皂苷的最佳修饰条件,并按照最佳修饰条件对绞股蓝皂苷进行修饰得到磷酸化绞股蓝皂苷(pGP),探究绞股蓝皂苷(GP)、磷酸化绞股蓝皂苷(pGP)抗Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus 1,DHAV-1)感染鸭胚肝细胞(duck embryonic hepatocytes,DEHs)的药理活性、体外抗DHAV-1的作用机制、对鸭Mφ活性的影响,旨在研究一种新型抗病毒药物。本试验分为以下四个部分:试验Ⅰ绞股蓝皂苷磷酸化修饰及其在鸭胚肝细胞上的安全浓度測定 本试验旨在筛选出绞股蓝皂苷磷酸化修饰的最佳修饰条件,并对磷酸化修饰后的绞股蓝皂苷的结构进行鉴定。本试验以三偏磷酸钠和三聚磷酸钠作为磷酸化试剂,并利用正交设计助手设计正交表L9(34)进行正交试验,并根据正交试验的结果筛选出磷酸化修饰的最佳修饰条件,之后采用FT-IR对修饰前和修饰后的绞股蓝皂苷进行结构鉴定。结果表明,当pH为9,反应时间为4h,反应温度为65℃为磷酸化绞股蓝皂苷的最佳工艺。150 mg绞股蓝皂苷经最佳工艺制得的药品质量为159.6 mg,磷酸化修饰产物中磷酸根含量为32.59%,皂苷含量为67.08%。用MTT法测定了绞股蓝皂苷和磷酸化绞股蓝皂苷在鸭胚肝细胞上的最大安全浓度分别为100 μg/mL和25 μg/mL。试验Ⅱ磷酸化绞股蓝皂苷抗DHAV-1感染鸭胚肝细胞作用的研究 为观察GP和pGP对抗DHAV-1的感染作用,本实验将GP和pGP从最大安全浓度进行倍比稀释5个浓度,分别以先加病毒后加药物、先加药物后加病毒以及药物与病毒同时加入3种加药方式加到鸭胚肝细胞(DEHs)单层中,采用MTT法测定了不同浓度的GP和pGP对DHAV-1感染DEHs的影响;采用实时荧光定量PCR方法比较分析了最有效作用浓度的GP和pGP对DHAV-1在DEHs上的吸附、复制和释放的影响。结果表明:GP和pGP都具有较好的体外抗DHAV-1的作用,且在先加药后加病毒和先加病毒后加药作用方式下,pGP的抗DHAV-1的作用效果优于GP。在先加药后加病毒作用方式时,GP和pGP均能有效抑制DHAV-1的吸附;在先加病毒后加药作用方式时,GP和pGP对DHAV-1吸附鸭胚肝细胞没有明显的抑制作用,但在此种加药方式下,GP和pGP均能有效抑制DHAV-1的复制和释放,且pGP的抑制效果优于GP。本研究表明磷酸化修饰显著提高了绞股蓝皂苷的直接抗DHAV-1作用,磷酸化绞股蓝皂苷有希望被开发成一种新型抗DHAV-1药物。试验Ⅲ磷酸化绞股蓝皂苷对DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞凋亡的影响 为了进一步研究GP和pGP的抗病毒作用机制,我们选用了 GP和pGP的最佳抗DHAV-1浓度进行本试验的研究,采用TUNEL法和Annexin V/PI流式细胞分析法检测GP和pGP对DHAV-1诱导的鸭胚肝细胞(DEHs)凋亡的影响。TUNEL法测得的试验结果显示:与细胞对照组相比,DHAV-1可诱导DEHs发生明显的凋亡(p<0.05),凋亡率升高了 24.19个百分点;与病毒对照组相比,GP和pGP均能显著抑制DHAV-1诱导的DEHs凋亡,显著降低细胞凋亡百分率(p<0.05),凋亡率分别降低了 17.42和20.90个百分点,pGP的作用强于GP。Annexin V/PI流式细胞分析法测得的试验结果显示:与细胞对照组相比,DHAV-1可诱导DEHs发生明显的凋亡(p<0.05),凋亡率升高了 26.26个百分点;与病毒对照组相比,GP和pGP均能显著抑制DHAV-1诱导的DEHs凋亡,显著降低细胞凋亡百分率(p<0.05),凋亡率分别降低了 14.70和22.67个百分点,pGP的降低作用显著强于GP。Annexin V/PI流式细胞分析法测得的试验与TUNEL法测得的试验结果基本一致,这说明pGP可通过抑制DHAV-1诱导的DEHs凋亡来发挥抗DHAV-1感染作用,且pGP的作用优于GP。试验Ⅳ磷酸化绞股蓝皂苷对鸭Mφ活性的影响 为研究GP和pGP对鸭腹腔巨噬细胞活性的影响。本章节采用中性红吞噬试验、代谢MTT活力试验和ELISA法分别测定了 GP和pGP对鸭腹腔巨噬细胞的吞噬活性、对鸭腹腔巨噬细胞代谢MTT活性和对鸭腹腔巨噬细胞分泌炎性因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的影响。研究结果显示:在GP和pGP浓度为100 μg/mL和25 μg/mL时,巨噬细胞吞噬中性红的能力达到最强,吞噬指数最大,巨噬细胞代谢MTT活力达到最强;另外,在该浓度时,GP和pGP均能显著促进无LPS刺激的正常巨噬细胞分泌炎症因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α,且pGP的促进作用显著强于pGP;另外,GP和pGP均能显著抑制LPS诱导的非正常巨噬细胞分泌炎症因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α,且pGP的抑制作用显著强于pGP。上述研究结果表明:GP和pGP体外均能增加鸭腹腔巨噬细胞的细胞活性,且pGP的作用强于GP。